Способ получения бактериальных суспензий

СО 03 СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИК А 1 Б 46 4 С 12 Н 1/О ГОСУДАРСТВЕННЫПО ИЗОБРЕТЕНИЯМПРИ ГКНТ СССР ОМИТЕТ ОТКРЫТИ но-исследователь нологии и ИнстиД.Н.Островский,Н,Грязнова,а, Г,Б.Бравова,в, Е.А,Шабанова,Сорокина т. 46,АКТЕРИАЛЬНЫХ кр сится жет бы поль"рованстабил роорганизмов. эобретение хими логи эовано для полу ных мембран клеЦелью изобре лизация мембран так и находящих шенных клеток б к микроо ниэмов я стаб ени как изолир я в состав ктерий разл ванных неразручных мембр ан и в количестполяро грамл. Добавве субстраскоростьроль) . нтов, вызывающи ия на 507, Конрцина от 5 ОПИСАНИЕ ИЗОБР А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ(71) Всесоюзный научский институт биотехтут микробиологии АН(57) Изобретение отнологии, биохимии и мозовано для получениных мембран клеток ми носится к микробио-. может быть испольния стабилизировант таксономических групп.П р и м е р 1. Суспенз Ю.сгососсця 1 уяоде 111.сця ве 1 мг белка/мл вносят в фнческую ячейку объемом 1 ляют НАДН и малат в качест тов дыхания, Регистрируют поглощения кислорода (конт Целью изобретения является стабилизация мембран как изолированных, таки находящихся в составе неразрушенныхклеток бактерий различных таксономических групп (что приводит к стабилизации клеток бактерий). В суспензию клеток бактерий и мембран микроорганизмов вносят стабилизирующийагент в концентрации (0,2-7,0)х10 Моль. В качестве стабилизирующего агента используют алкилрезорциныс насыщенными алкильными радикаламидлиной от 4 до 1 О атомов углерода,находящимися во 2-,4- или 5-м положении в бензольном кольце. Стабилизированные суспензии клеток бактерий и мембран микроорганизмов различных таксономических групп хранятсяв течение 0,5-2,0 лет при температуре 1-25 С 4 табл. Затем в ячеику дополнительно вносят алкилрезорцин до концентрации 5 10моль, через 1 мин после внесения регистрируют дыхание суспензии. После чего добавляют алкилрезорцин до концентрации АЙ 0моль, регистрируют дыхание суспензии. Операции 1повторяют при внесении алкилрезорци-ьнов до концентрации 1 О моль с шаго концентрации в два раза больше предыдущей,Полученные данные приведены в табл,1, где указаны концентрации стабилизирующих аге е ингибирование дыханцентрации алкилрезо1463754 51 О 20 25 40 45 50 5510 .6 моль до 0,210 моль не вызываютподавление дыхания на 507.П р и м е р 2. Культуру В,сегецявыращивают на жидкой синтетическойсреде следующего состава, г 7 л:ВНН РО, 1,0 КС 1 0,2) Мф 04 к 7 НО0,2; СаС 1 0,002; глюкоза 4; мясопептонный бульон 07, (об/об) при аэрации 1 л воздуха (1 л среды) достадии перехода вегетативных клеток встационарную фазу роста. Суспензикклеток В.сегеця с ОП = 2,0 вносятв полярографическую ячейку объемом1 мл. Опыт проводят согласно примеруПроведенные исследования показывают, что при внесении моно- и диалкилреэорцинов с насыщенным алкильнымрадикалом длиной от 4 до О атомовуглерода, находящимися во 2-, 4- или5-м положении в бензольном кольце вконцентрации 0,2-7,0 10моль, всуспензию изолированных мембран, таки клеток бактерий происходит ингибирование ферментов ЭТЦ, что свидетель -ствует об их стабилизации (табл.1).П р и м е р 3. В суспензию мембран М,1 уяос 1 еИ 1.сця вводят гидрофобный зонд пирена до конечной концентрации 15 мкМ. Во флуориметрическуюкювету помещают суспенэию мембран вколичестве 0,2 мг белка/мл. Регистрируют спектр флуоресцентности пиренапри возбуждении (335 нм). Из соотношения интенсивности флуоресцентностиэксимеров (470 нм) и мономеров(393 нм) оценивают параметры эксимеризации (контроль). В суспенэиюмембран с введенным зондом пиренавносят 5-С, алкилрезорцин в количестве 0,2-1,010 4 моль. Проводят измерения аналогично контрольномуварианту.Данные приведены в табл.2.Из полученных результатов следует,что параметр эксимериэации пиренаснижается по мере увеличения концентрации алкилрезорцина. Алкилрезорцин1существенно снижает латеральную диффузию липидов в мембране, что свидетельствует о стабилизации липидов в мембране.П р и м е р 4. Культуру В.сегецявырашивают на жидкой синтетическойсреде, состав которой приведен впримере 2,В одну часть суспензии В.сегецявводят алкилреэорцин 4-С, с конечнойконцентрацией 0,510 моль, а др 4гую до конечной концентрации 4-С 2,5 )О ф моль, Стабилизирующий агент вносят в суспензию вегетативных клеток в фазу замедленного роста (ОП =2,0), через 1 ч после внесения стабилизирующего агента клетки микро- скопируют, При рефрактометрическом определении степени рефрактильности клеток после внесения 4-С с конечной концентрацией 0,510М и 2,5 О- М установлено, что клетки приобретают степень рефрактильности (п) аналогичную бактериальным эндоспорам(и эндос пое1,47; п вегет, кл36 ф и, о- 1,42), Полярографическое определение дыхания клеточной суспенэии показывает. отсутствие поглощения кислорода, т.е. полное ингибирование ферментов ЭТЦ, На протяжении2 лет при хранении полученных суспенэий при температуре от 1 до 25 Сактивность ЗТЦ не выявляется, Клеткипри микроскопировании в фазовом контрасте не теряют высокой степенисветопреломления и сохраняют своюцелостность, Оптическая плотность клеточных суспензий за время хранения не меняется, что свидетельствует об отсутствии деградационных процессов.В табл.3 приведены условия стабилизации суспензии мембран М.1 уяойеЪхсця при внесении стабилизирующихагентов - алкилреэорцинов (4-С 5-С о), П р и м е р 5. В суспензию мембран М,1 уяодеЪгсця с количеством 2,0 мг белка/мл вносят 4-С, до конеч -ной концентрации 0,510М. Суспензию стабилизированных мембран хранятв течение 6 мес при 1 С, С периодичностью в 1 мес проверяют оксидазнуюактивность ферментов ЗТЦ при использовании в качестве субстрата малат,а также определяют оптическую плотность суспенэии. На протяжении всего периода хранения активность ЗТЦ не выявляется,ОП суспензии не снижается, Зто свидетельствует о стабилизации и сохранности мембранных препаратов,В табл, 4 даны условия стабилизации суспензий мембран В.сегеця привнесении стабилизирующих агентовалкилрезорцинов (4-С, 5-С,).П р и м е р 6, Условия проведенияопытов приведены в табл. 3. О стабильности суспензий мембран судят по пара1463754 таксономического положения бактерий,из которых выделены мембраны,и хранить стабилизированные суспензиибиологических мембран и клеток бактерий длительное время (0,5-2,0 года) в широком интервале температурот 1 до 25 С. Формула изобретения Способ получения бактериальных суспензий путем введения стабилизирующего агента, о т л и ч а ю щ и й - с я тем, что, с целью стабилизации мембран как изолированных, так и находящихся в составе неразрушенных клеток бактерий различных таксономических групп, в .качестве .стабилизирующего агента используютмоно- и диалкилрезорцины с насыщенными алкильными радикалами длиной 4-10 атомов углерода, находящимися в 2-,4- или 5 - м положениях в бензольном кольце, в концентрации (0,2"7,0)10 моль,Таблица 1 Ал О,б (НАДН) 0,6 (малат) 2,7 (НАДН), 5,0 (малат) 3,0 (НАДН) 1,1 3,5 70 Не ингиб р ует. 4 5-С" ф е и 1,2 (НАД 0,6 (НАД 0,25 (Н О, 7 (НАД 1, 1 (НАД адат) Н) 5-С 2-С 2-С3 2-С -5."С 1 О 9(м килрезорцины, имеющие алки нее 4-х атомов углерода, н адикалы с длинойтивны в указанзирующего агента. льные е эФф стаби о иапазоне концентраци метрам, описанным в примере 5, определения проводят с той жз периодичностью, данные соответствуют вышеприведенным ре зульт ат ам.П р и м е р 7. Опыты проводят аналогично примеру 5, но с суспензией мембран В. сегецз. Условия проведения опытов приведены в табл,4, Параметры, свидетельствующие о стабильности сус О пензии мембран В.сегеиз, определяют в соответствии с примером 5, с той же периодичностью. Результаты опытов идентичны данным 5 опыта примера 5,Таким образом, предлагаемый способ получения стабилизированных суспензий биологических мембран позволяет стабилизировать как изолированные 20 мембраны, так и находящиеся в составе неразрушенных клеток бактерий, что В последнем случае приводит к стабилизации клеток бактерий, стабилизи-:ровать мембраны вне зависимости от руюшая дыхание мембран с контролем, и 10мо ых мембран М.1 узойед 1 сзогенных субстратах1463754 Таблица 2 Концентрация5-С,10 М О 0)2 0,3 0,8 1,0 Эксимериэация 0,25 0,16 0,09 0,07 0,065 Таблица 3 Таблица 4 20 0 2 ,0 02 4 С 0,2 4-С 2,0 4 С 15 15 2,5 1,0 25 0,22,0 2,0 Примеч ани ловнях суспенэии в течение 6 мес. ых усло Примечание. Вукаэасуспенэни сохраняют стабнльнние 6 мес. е, В укаэанных усохраняют стабильност ь в теч Составитель А.ФедоровТехред Л.Олийнык Корректор И.Муска актор Г,Волков каэ 790/3 1 Тираж 500 Подписноеарственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ С113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 В оиэводственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина,101 2,0 0,2 2,0 2,0 С ь -С1 О а -Со -С 1 о 0,5 2,5 0,5 2,5 0,5 2,5 151115