Гексапептид, обладающий противоязвенным действием

СОЮЗ СОВЕТСКИСОЦИАЛИСТИЧЕСКРЕСПУБЛИК О КСАЧ АВТОРСКОМУ ЛЬСТВУ кий научный в, В,М,Полон-, ов, М,Л,Якувчинников и венные средс.317,т, И,с. р. "КеаеО СЕГОО.; Ч1 еююй ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ О ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЬГГИЯМПРИ ГКНТ СССР йЕ КЗОБР 21) 426264804(22) 19.06.8746) 15.10.91, Бюл, М 3871) Всесоюзный кардиологичецентр АМН СССР(72) В.А,Виноградов, М.И,Титоский, Н, В, Коробов, А. С, Сокошева, Ж,Д,Беспалова, М,В,ОБЛ.Пекалис531 547.964.4,07033, Я)156) Мад:ковск:"д,г,. Лекаратства, М Медицина, 1084, т. ,294,Зовегу 1 е К,1 Ф. и дапбзесГееогу аоепи тог рертсОЯ 1 ЯЯ 3 , 2,),ф Изобретение относится к новому биологически активному соединению гексапептиду фоомулыТуг-О-Аау-Рпе-Ееи-ОЬ-ОН,обладающему противоязвенным действием, которое может найти применение в медицине.Цель изобретения - поиск новых соединений пептидной природы, обладающих бо лее высокой противоязвенчой активностьюпри пероральном применении и низкой токсичностью,П р и м е р 1. Ди-трет-бутиловый эфиркарбобензоксилейцил глутаминовой кислоты (1).6,83 г (17,41 мМ) ди-трет-бутиловогоэфира карбобензоксиглутаминовой кислотырастворяют в 35 мл метанола и гидрируют вприсутствии паллэдиевОГО катализатора втечение 4 ч, Катализатор отфильтровывают,промывают на фильтре метанолом, фильт-. 1)5 С 07 К 7 ОЬ(А 61 К ТО 02 254) ГЕКСАПЕПТИД, ОБЛАДАЮЩИЙ ПРО ТИВОЯЗВЕННЫМ ДЕЙСТВИЕМ 57) Гексапептид формулы Туг-О-Аау Рпе-еоО-ОЙ, обладаюший противояз венным действием,ратупаоивают, растворяют в 25 мл диметилформамида ЦМФА), К раствору АООавлягот 4,50 г 17,41 мМ) и-нитрофенилового эфи;а карбобензоксилейцина. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение суток. Растворитель упаривают, остаток растворяют в 10 мл смеси этилацетатггексан 2:1) и наносят на хроматографическую колонку 1 ОЬаг С (440-37) ОСЬГоргео 51 60(63 - 125 мм) - "МегсМ" ФР ;, Хроматографию производят в изократическом режиме элюэнт - этилацетат:гексан 2:1). Фракции, содержащие целевой продукт, собирают, упаривают, сушат в вакуумэксикаторе. Получают 6,02 -(68 ь) продукта, Бесцветное масло а.О = -24,2 С 1, ДМФА), Б 1: 0,22 этилацетат;н-гексан 1:2 (А, 0,61 толуол:ацетон:метанол;уксусная кислота 14;1:4;1 (Б, 0,50 толуол:н-Гептан;метилзтилкетон 5:3:1 В.Ди-трет-бутиловый эфир карбобензоксифенилаланил-лейцилглутаминовой кислоты (,1,56 г (3,09 мМ)растворяют в 10 млметанола и гидрируют в присутствии палладиевого катализатора в течение 3 ч, Катализатор Отфильтровывают промыВают нафильтре метанолом и фильтрат упаривают,Остаток растворяют в 5 мл ДМФА, добавляют 1,30 г (3,09 мМ) и-нитрофенилового 10эфира карбобензоксифенилаланина, Реакционную смесь перемешивают при комнатной темггеаатуре в течение суток. Растворитель упарлвают, остаток растворяют в30 мл этилацетата. Этилацетат промывают 152-ной серной кислотой (20 млх 2) и водой(20 млх 2), упаривают, добавляют 25 мл изопропилового спирта и упаривают, Остатокрастворяют В диизопропиловом эфире, выпавшие кристаллы Отфильтровывают, промывают на фильтре диизопропиловымэфиром и сушат в вакуум-зксикаторе. Получают 1 55 г (85/) продукта с т пл 120 С1, 20 2: 6(С 1,г 1)-)А) , О, 23 Р)(Б), 0,29 (В). 25Ка рбобензокси-Д-аланил-глицил (И),0,50; (7,68 мМ 1 глицина растворяют в7,68 мл 1 н, раствора едкого натра и добавляют раствор 2,74 г (7,78 мМ) и-нитрсфениЛОВОГО эфира карбобензоси-Д-аланина в 3020 мл ДМ)7 А, Реакционнуюме ь Геремешива;от при комнат но:" гем;пегятуре в трние суток. Раствор упзривают, остатокрастворя 7 от В воде, зкстрагируют зфирсм(50 мл 7 З), водный сло: г,:одкисляют 2 н, серной кислотой до рН = 2 и экстрагируютэтилацет. том (50 мл х 3). Зтилацетат промывают водой (30 мл х 2 ь добавляют 50 млизопропилового спирта и упаривают. Остаток заливают эфиром (100 мл), образовавшиеся кристаллы отфильтровываот,поомывают на фильтре и сушат в вакуумзксикатоое, Получа 7 от 1,40 Г 65) прОдуктЯ26 " ) 7. ( 2, 2 п 7 оМеОН), Яг: 0,67 (хлороформ:метанол:32 Я, - 45нзя уксусная кислота 60:45:20 (Г, 0,71 (этилацетат;пиридин;уксусная кислота: вода45:20;б;11 (Д, 0,35 (хлористый метилен:метанол:50-ная уксусная кислота 85;15:2 (Е,М-трет-бутилоксикарбонлл-о-бензилтирозил-Д-аланил-глицин (Ч 1.1,66 г (5,90 мМ)растворя 7 от в 20 млметанола и глдрируют в присутствии палладиевого катализатора в теченив 3 ч, Катализатор отфильтровывают, громывают на 55фильтре метанолом, фильтрат упаривают,Остаток растворяют в 5,90 мл 1 н. раствораедкого натра. К раствору добавляют 2,91 г(5,90 мМ) п-нитрофенилового эфира ),-третбутилоксикарбонил-о-бензил-тирозина в 25 мл ДМФА, Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение суток. Раствор упаривают, остаток растворяют в воде, зкстраглруот эфиром (50 млу х 2), водный слой подкисляют 2 н, серной кислотой до рН =-2 и зкстрагируют зтллацетатом (70 мл х 3)тила 7 етат промываот водой (50 мл х 2), добавляот 50 мл изопропилового спирта и упари аают. Ост,":то 7 залиВВЯт эфирОм ,150 мл), Образовавшиес кристаллы отфильтровь Веют, промывают на фильтре эфиром, сушат в вакуум-экслкаторе, Получают 2,62 г (89 ) поодута с т.пл.100 - 100,5 С, ( а Ь =-9,3 (С 1, ДМОА), Яф: 0,74 (Д), 0,57 (Е), 0,36 (хлороформ:метанол:уксусная кислота 9:1:О 5 (Ж.и-Нитрофениловьй эфир М-трет-бутилоксикЯрбон ил-О-бензил-тирОзил-Д-аланилглицина (Ч).3,50 г (7,03 мМ) (И) и 1,02 г (7,33 мМ) п-нитрофенола растворяют в 25 мл ДМГ) А, раствор оаждаю до -25 С, добавля:От 1,54 г (7,33 мМ) длцлклогексллкарбодииллда в 10 мл ДМФА. Реакционную смесь пере мешивяют при -250 С а течение 45 мин, затем температуру доводят до О С и вьдерживаю; при эой температуре в течение суто. Еь павц 3 ие кристаллы дициклогесилмзчепи, ь ОтфильтравыВяют, промьвэют ня фильтрате ДМА. филь-рат упаривают, остато переристаллизоВывяю: из изспропиловоГО спирта,;7 олучают 3,63 г Г 83 продкта с 0,87 (Е), 0,69 (хлороформ:метанол:уксусная кислста 32:2:1) 0,41 (н-буга,ол;ьуравьиная кислота:вода 15:3 ).Ди-тает-бтиловый эфир Н-т;,ет-бтилоксикарбонил-о-бензил-тйрозил-о-аланил -глицил-фенилаланил-лейцил-глутам";новой кислоты (И).209 7 лг (032 м.4) ) растворяюг Б 15 мл метанола и глдрируют н прис тствии паяла диевого катализатора в течение 3 ч, Ка ализатор Отфильтровываю.г. промызя от на фильтре метанолом, флльтр упаривают. Остаток растворяют в 10 мл ДМОА иобавляют 200 мг (Ч). Реакционную смесь перемешлвают и ри комнатной темгературе в течение суток. ДЧФА угарива,от, остаток дважды переосаждают из метанола (5 мл) эфиром (300 мл), получают 266 мг (84;ь) продукта с т,пл, 200 - 201 С, ( а о = -19,2 (С 1, ДМфА), Кг, 0,88 (Г), 0,89 (Д), 0,58 (ж).Ти разил-Д-алан ил-глицил-фенилаланил-лейцил-Г.утаминсвая кислота.240 мг (0,24 мМ) ф) расгворяют в 15 мл уксусной кислоты и Гидрируюг в присутствии палладиевого катализатора в течение 3ч, Катализатор отфильтровывают, промывают на фильтре уксусной кислотой и фильтрат упаривают, Остаток растворяют в 15 мл трифторуксусной кислоты и выдерживают в течение 30 мин при комнатной температуре. Раствор упаривают, остаток заливают 50 мд эфира, выпавший осадок Отфидьтровываот, промывают на фпльтрезфирзм, растворяют В 50 м" 10 Ъ- о" уксусной;ислоты и ОбраЬ;-.,ТЛ ъ ;Г.Р. ;ОНГ ,".Р.;-Иной Смолой ООИех, л., ,.,О-,;мо Смолу Г;ч дьтровывают, про;аают на,. ъ,.ьтре 1%Ной уксуснОЙ кис лот",й, Фи 1:.=трат упаоиваюГ, 1 олученныЙ Г 1 Р.,Д 1.КТ ОЧ 1;К,М ГОДОМ:РОТИВОТОЧНОГО:;оп .8."ел";,и ";-. -.,Да;-:етарн Ой центрифуге в системе н-бу.;НОЯ;уксусная кислота:вода 4,.:, Стг.ци чарная фаа - оогаиическая. Фоакнии СОД 86 ЖВГЦ":- ЛЕВОЙ ПРО "Ук СО- бирс."Пт, упарИВ,ГОТ, добаВДЯЮТ 50 Мя ИЗО пропиловсо сп .-.т:., упаривают остаток, переосахдают из м" :БОля ,3 мл эфиром0 мл 1 образовавшийся Осадок Отфильт ровывают, пром са.,".т на фидьтр 8 зфирОм, сушат В Бакч:,;-зкс:,лагоре, Получают 92 мгч 1 Г"О р,"7:-:= + 9 8 6 10 /Э АОО.1;1, .",: 0.74 (Г), Г,42 (Д), 0,48 Гн-бутанол:уксу .ная кислоа вода 1:1:1), Данные а Я н ", 1ло н Гр ч,иза ".данин 1 02 1) Глиин ,00,1.,:;т миновая к,;слота 1,04 1,"., ейцин .,02, - :розин 0,99 (1), фенилаланин 1,03 , 1 .".н:чы Высокоэффективной .,:ид:; с", .зй:О,-". Гс Графии: пептид злюиро-;,;ся; н, и -л .-, 36,24 ф, Градиента на 2,. =;,:Ин.:.;,Дс". а 2 ЬО х 4,6. Мм; ц ;гав .пега,.:, - ,"-,л-,: - Одвижная фаза А: 0,05 Д Кц,пг,1 з, ,1 декад -у Щ Я за 20 мин;аале.ие 15".Ь г:Ь, скорость 1 млмин, Дт.к: И-,; ОЯ./:гиви -уа". Ность;Одученного соединения подтверждают спектром ПМР.р-,ове Воны биодг 1;ически - испытания ОПИСЫ ВЭВМОГО ГВКГ:;:.П 8 ПТИДЭ.П р и м 8 р 2, Испытан:.я протиаоязвенНОГп действия Гексапептида пООВОдят на крысах самцах линиА ГГистэр. РазВити 8 Язвенных поражений двенадцатиперстной кишки у крыс ызывают путем подкожного Введения цистеаГина Гидрохлорида В дозе 3"ъР мг,кг разведенного в 0 5 мд физиологического раствора. Сразу же после введения цистеамина гидрохдорида и чеоез 6 ч крысам с ггомощью з" утрижелудочного зонда вводят Внутрь предлагаемый гексапептид В дозах 10 и 100 мкгйг, деда ргин в дозе 1 О 0 мкг/кг или циметидин В дозе 10 мг/кг, растворенны 8 В 0,5 мл 3,-ного молОка, разведенного В 5 раз физиологическим раствором, КОнтрольной Группе жиВОтных после Введения цист 8 амина Гидрохлорида ВВОдят внутрь 3-ное;одоко., разведенное в 5 раз физиологическим раствором. Забой животных производят методом декапитации через 24 ч после введения цистеамина гидрохлорида и с помощью бинокулярной 5 лупы ( ха) оценивают состояние слизистойободочки двенадцатиперстной кишки, Для ."ждой Групп",.: крыс подсчитывают сред н:ою тяжесть пора:к.";ния ТП), выраженную : - баллах ф - Отсутствие зрозивно-язвенных 10 ппоа., енир 1 - зроьи2 - адиничная Язва;.": - Множествечн"о Язвы, 4 - прободные Яз-;ы). Кроме того, в каждой группе определя:;. т час-оу пораже .ий Ч П), КОТГ 1 оая преп- -:,": .В,лет собой Отношение числаживотных ;.;:эвами к общему числу Выживших к концу з:,:с;-:.Мента животных, В качеств сум, зрн Го гок", теля яззоооразовния опре ,:-с:,Я.от условньй Язвенный индекс ЯИ). ".0 Статисгическую обработку полученных реЗ;.Дь-:-ТОВ ПрОВОдят С ПОМОШЬЮ Т-КритгрИЯ Ст оден-,з,дс:я ТП) и Х" -критерия Пирсона ,.:;, Ч П), За до:товерные принимают разли.,в,.аровне значимости 95 (при Р 0.05).25 П;л., енные результаты представлены вКак следует из табл,1, предлагаемьй.-е.;:,знтид при введении внутрь зависимо О;,: з:. пре,"отврашае. Язвообразование в 30 дзена.,цатиперстной кишк 8 коыс и снижаетЯИ В соз 8100 мкг,к на 63;4, Противоязвенная активйость гексапептида в дозе 100 мкгйг была несколько Выше противоязвенной активности циметидина в дозе 10 мг/кг.35 Дедаогин при введении внутрь Обладал слабы.-: про гивоязвенным действием, снижая Яь, лишь .ы 26 , причем зто снижение не являлось с:.атически значимым.П р и м е р 3. Гексапептид 3 был изучен 4 о В зкспеоиментальной модели индаметацинсвь-:., Лзв тонкого кишечника, где протиВО- язвенное дейс вие гексагептида срав;иваи с противоязвенньм действием сульфасадзина. Индометацин вводят кры:. а , внутрь вдозе 20 мгКгс помощью внутрижедудочного зонда в виде суспензии в 0,5 .мс физиологи Геского раствооа. Предлагаемыекптиддо 00 маг/ кг или урь фас:азин В до"е 200 мг/кг вводят сразу же 50 и через 6 ч после введения индометацина В0,5 кл разбавленного В 5 раз Физиологическим раствором 3;4-ного молока. Контрольной гоуппе животных сразу же и через 6 ч после введения индометацина вводят 55 внутрь 3;-ное молока, разведенное в 5 раэфизиологическим раствором. Забой животных методом декапитации производят через 24 ч после введения индометацина и подсчитывают с помощью бинокудярной лупы количество язвенных дефектов слизи1460965 Таблица Влияние гексапептида 1, циметидииа и деларгина ца возникновение цистеаминовых дуоденальиых язв пои приеме внутрь;100 мкг/кг) 1, 2 =-0, 2 Я 2 приРазличи 8 с коитрольн й на уровн 8 эиа пп 0,0;.,Таблица 2 гексапептида и сульфасала овых язв в тонком киаечни Влияние предлагаем индометацзина на развитие е крыс,пы животных Количество животных Соеднее количество 48.78 6,0 КоитролГЦ)едла гав; Гексапеп 5,36 12 12 Различие с контролной руппой достоверно на ур.К Тираж Подписноерственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская иаб., 4/5 аз 4593 ВНИИА Госу роизводственио-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 1 стой оболочки 30-сантиметрового дистального отрезка тонкой кивки, где возникновение язв было максимальным. Для каждой группы определяют среднее число язв в ки" Ш 8 Ч НИ Ке. 5Статистическую Обработку полученных результатов проводят с помощью 1-критерия Стьюдеита. За достоверные принимают различия иа уровне значимости 95 (при Р 0,05). Полученные результаты представ- .0 лены В табл.2.Как следует из табл,2, предлаГаемый Гексапептид 1, использованный в Дозе 100 мкГ/КГ, снижает ср 8 диее КОличество язв В ДистальиОЙ части тОнкОГО кишечника крыс 15 на 52. противоязвенная активность предлагаемого гексапептида не уступает противоязвенной активности сульфасалазина, примененного в дозе 200 мг/кг, который уменьшает количество язв в кишечнике наВо всех экспериментах с применением предлагаемого гексапептида 1 не отмечалось изменения со стоосиы клеточного состава крови Основных гемодинамических показателей. Острая токсичность предлагаемого гексапептида 1Оо составляет 250 цг/кг,Таким образам, синтезирован новый гексапептид формулы 1. который обладает низкой токсичностью, бол 88 уни 88 рсальиым ПРОТИВОЯЗВВИИЫМ Л 8 ЙТВИ 8 М "8 и Циаме И- дии или сульфасалазин, пр 8 вышает активность тих поепаратов э 1 п 0 и И 00 оз