Способ выявления нейронов при люминесцентной микроскопии

)9) Я 1/2 ТЕНИ НОВ ПР 1 ВЫЯВЛЕНИЯ НЕЙЮИ МИКРОСКОПИИ(54) СПОСО ЛЮМИНЕСЦЕН (57) Изобри. Для ум ля из кл ение относит к гистол ии краси- ческого еньшения дифф ток и неспециф ги те мозг вв на и кр примулин -2 и во - тологиче ают в из рН 7-7,ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ ОПИСАНИЕ ИЗОБ А ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ(56) УеягегяЯ К.Р. ес а 1., А гесгоегайе 1 аЬе 1 ггас 1 пц гесЬп 11 це цядпя Ьогяегай 1 яЬ регохЫаяе апд где Х 1 цогеясепг. - 1.Иецгоясд, МегЬойя, 1981, ч. 4, М 1, р. 53-62.Авторское свидетельство СССР У 1104376, кл, С 01 И 1/28, 1984. свечения других структур в дят раствор пероксидазы хр ситель, содержащий, мас.Е: 5-10, диметилсульфоксид 1, да - остальное, Готовят ги кие препараты. Срезы промы тоническом фосфатном буфер в течение 20-30 мин. 2 таб18839 5 10 15 20 25 ЗО 35 40 45 50 55 1 13Изобретение относится к медицине, а именно к гистологии, и может быть использовано при изучении организации нервных центров и характера дивергенции аксонных коллатералей в головном и спинном мозге, а также при изучении проводящих путей в периферической нервной системе.Цель изобретения - уменьшение диффузии красителя из клеток и неспециФического свечения других структур мозга благодаря использованию приму- лина с добавкой диметилсульфоксида, обеспечивающих высокую степень связывания с белками цитоплазмы.П р и м е р 1. Животному (белая крыса) производят микроинъекцию в мозг (в разные отделы хвостового ядра) 1 мкл 30%-ного водного раствора пероксидазы хрена и 1 мкл 10 -ного водного раствора примулина с добавлением 2 циметилсульфоксида. Через два дня животное перфузируют фиксатором - раствором параформальдегида и из фиксированной ткани мозга изготавливают на замораживающем микротоме срезы толщиной 30 мкм. Производится гистохимическая окраска срезов (известным способом). Срезы промывают 30 мин в холодном фосфатном буфере (О, 1 Мф рН 7, 2) с добавлением 10 са" харозы, натягивают на предметные стекла и высушивают, а затем обезвоживают в спиртах, просветляют в толуоле и заключают в нелюминесцирующую среду (эпон 812)Наблюдение окрашенных примулином и пероксидазой хрена нейронов производится в обычном свете и свете люминесценции при длине волны возбуждающего света 300- 450 нм. Двухцветное свечение клеток- темно-синее и золотистое - указывает на двоййое их окрашивание Флюорохромом лл Ферментом. П р и м е р 2. Способ осуществляют по примеру 1, однако концентрация примулина в инъецируемом растворе меняется. Интенсивная аккумуляциячкрасителя в нейронах наблюдается при концентрации его в инъецируемом растворе 5-10 . При увеличении концентрации красителя увеличивается и интенсивность его аккумуляции в нейронах. 10 -ный водный раствор примулина является наиболее оптимальным, однако такой раствор является уже насыщенным для данного красителя. Снижение концентрации примулина (менее 5 ) приводит к уменьшению свечения меченных Флюорохромом клеток.П р и м е р 3. Способ осуществляют по примеру 1 за исключением концентрации диметилсульфоксида (детергента) в инъецируемом растворе примулина. Более эффективный захват красителя в зоне микроинъекции и егоретроградный аксонный транспорт наблюдается при концентрации диметилсульфоксида 1,5-2 . Увеличение концентрации диметилсульфоксида (более2 ) приводит к деструктивным изменениям ткани в зоне микроинъекции, ауменьшение его концентрации (менее1,5 ) снижает его эффективность как детергента. Оптимальное значение концентрации диметилсульфоксида состав-.ляет 1,8 ,Зависимость интенсивности флюоресценции окрашенных примулином нейронов от его концентрации и концентрации детергента (диметилсульфоксида) в инъецируемом растворе приведена в табл. 1П р и м е р 4. Способ осуществляют по примеру 1 за исключением длительности промывания срезов. Промывание срезов в холодном иэотоническом ФосФатном буфере восстанавливает частично погашенную люминесценцию клетокпосле гистохимической окраски. Длительность промывания составляет 2030 мин, оптимальное время 25 мин.При сокращении этого времени (менее20 мин) не наблюдается полного восстановления свечения окрашенных примулином клеток, а при удлинении промывания (более 30 мин) происходит вымывание красителя из клеток, что снижает интенсивность их флюоресценции. П р и м е р 5. Способ осуществляютпо примеру 1 за исключением изменения кислотности фосфатного буфера. 1(ислотность среды является важным параметром для восстановления свеченияокрашенных примулином клеток. Лучшеевосстановление свечения достигнутопри кислотности изотонического фосфатного буфера 7,0-72. Оптимальноезначение кислотности среды при рН7,1. Уменьшение кислотности буфера(рН больше 7,2) приводит к неполному восстановлению свечения, а увеличение кислотности буфера (рН меньше 7,0) вызывает изменение спектра эмиссии люминесцирующих клеток.13 Таблица 1 Концентрация Интенсивность Концентрация Интенсивность примулина, % флюоресценции детергента, % флюоресценции 0 95,5 00 97,4 99,5 О 0(100%) флюонсивность За исходный уровеньресценции берут интсвечения примулинага в случае использщенного раствора фпю1,8% детергента. мечани срезах мозания насырохрома и Зависимость уровня восстановления флюоресценции окрашенных примулином нейронов от времени отмывания приведена в табл. 2. Оптимальные значения указанных параметров (концентрация красителя и диметилсульфоксида, время отмывания, кислотность буфера) получены в опытах на 170 крысах и 10 кошках.Предлагаемый способ по сравнению с известными способами обладает большей чувствительностью и точностью, так как в качестве одного из красителей используется водный раствор примулина с диметилсульфоксидом. Примесь диметилсульфоксида превращает примулин в транспортно-специФический краситель, длительное время удерживаемый в цитоплазме меченых клеток дп что и п чдСго. Примулин способен к прочному связыванию с белками цитоплазмы меченного им нейрона при отсутствии диффузии красителя из клетки. Примулин обладает высоким квантовым вы 18839 4 ходом, устойчив при ультрафиолетовом облучении. Формула изобретения5 Способ выявления нейронов при люминесцентной микроскопии путем микроинъекции красителя в мозг с последующим введением пероксидазы хрена Ю и приготовлением гистологическогопрепарата, отличающийсятем, что, с целью уменьшения диффузиикрасителя из клеток и неспецифического свечения других структур мозга, 15 в качестве красителя используют состав, содержащий примулин и диметилсульфоксид при следующих соотношениях компонентов, мас.%;Примулин 5-10Диметилсульфоксид 1,5-2,0Вода Остальноедалее .после введения пероксидазы хрена мозг промывают в изотоническомфосфатном буфере рН 7,0-7,2 в течение 20-30 мин%, рН 7,1 Восстановление флюоресценции, 7, за25 мин отмывания рН 0,5 3,3 20 4,0 10,1 65,3 10 5,0 22,0 98,5 6,0 60,3 20 100 7,0 100 100 100 100 7,2 30 100 98,9 94,5 35 7,3 40 7,5 50 60 20 8,0 20,5 П р и м е ч а н и е. За исходный уровень (1003) флюоресценции клеток берут интенсивность свечения флюорохрома (примулина) в фиксированных в форма- лине и не подвергнутых гистохимической окраске срезах мозга. Составитель Л.СоловьевТехред А.Кравчук Корректор А.Обручар Редактор Н.Тупица Заказ 2500/34 Тираж 776 ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5