Способ получения противогриппозных антител

СОЮЗ СОВЕТСНСОЦИАЛИСТИЧЕРЕСПУБЛИН 130140 б 1 К 39/12 ОПИСАНИЕ ИЭОБРЕТН АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ нстиучноследои и сол ечнико .Лозиц и сные инфек ера. 973 с СР ЯР ОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ(71) Физико-химическийим, А.В,Богатского и Нвательский институт виэпидемиологии им, И,И.М(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТИВОГРИППОЗННХ АНТИТЕЛ(57) Изобретение относится к медне и ветеринарии, предназначено дляпроизводства диагностических и лечебных сывороток, Цель иэобретенияпролонгирование повышенных титровантител, Для этого получают вирусосодержащую жидкость, используя 1 О 11-дневные куриные эмбрионы, в аллантоисную полость которых вводяталлантоисную культуру вируса гриппаА (Гонконг/1)68(Н 3112), Аллантоисную вирусосодержащую жидкость цент,рифугируют на холодпри 5000 об/мин20 мин для удаления механическихпримесей. Очистку вирусной суспензии ведут методом фильтрационнойхроматографии на колонках с макропористым силохромом. Очищенную вирусную суспензию инактивируют ультрафиолетовым облучением, Очищенныйинактивируемый вирус с титром 1;:800 ГА/0,2 мл совместно, в одномшприцЕ с трипсином и поливиниловымспиртом (массовое соотношение трипсина и поливинилового спирта 1:21:20) в объеме 0,15 М раствора хлористого натрия вводят подкожно лабораторным животным. В полученных изих крови сыворотках .определяют антигемагглютинирующую активность в реакции торможения гемагглютинации.Предлагаемый способ позволяет повысить титры специфических антител всыворотках крови животных-продуцентов в 2-12 раз, при этом увеличиваются сроки использования живртных,получают более высокотитражные сыво"ротки, которые используют для производства диагностических и лечебныхпрепаратов1 з,п, Ф-лы.русную суспензию тщательно пипетируют, центрифугируют на холоду при 2000 об/мин и надосадок вносят в колонку из расчета 1/4-1/5 объема столба МПС, После того, как вирус" ная суспензия входит в МПС, в колонку вносят буфер и при скорости 0,6 мл/см /мин собирают элюаты в мерные пробирки йо 2 мл. В каждом элюате определяют титр вируса. Элюаты с высоким содержанием гемагглютинирующей активности объединяют с учетом, что объем смеси элюатов не превышает 1/4-1/5 объема столба МПС. Таким образом, получают необходимый объем очищенной вирусной суспензии и определяют титр вируса, который, как правило, не отличается от титра вирусной суспензии до очи" стки.Очищенную вирусную суспензию инактивируют ультрафиолетовым облучением лампой БУФна расстоянии 17 см 30 мин при периодическом перемешивании.Очищенный инактивированный вирус с титром 1;8000 ГА/0,2 мл совместно (в одном шприце) с 2,7 мг трипсина и 5,4 мг поливинилового спирта (весовое соотношение трипсин:поливиниловый спирт 1:2) в объеме 1 мл 0,15 М раствора хлористого натрия вводят подкожно (в область задней конечности) однократно белым беспородным крысам массой 50-200 г.Лабораторным животным контрольной группы вводили соответствующую дозу вируса с максимальным количеством поливинилового спирта.Каждая группа состоит из семи лабораторных животных. В день иммунизации и затем на 14, 28, 35 и 42 дни производят забор крови из хвостовой вены крыс. В полученных из крови сыворотках определяют антигемагглютинирующую активность в реакции торможения гемагглютинации (РТГА). Перед постановкой РТГА для удаления неспецифических ингибиторов гемагглюти" нации сыворотки обрабатывают риванолом. Для этого к 0,1 мл сыворотки добавляют 0,4 мл 0,47-ного раствора риванола (рН 7,2-7,4), встряхиваюто и оставляют на 20 мин при 4 С. Выпавший осадок удаляют центрифугированием при 1500 об/мин 10 мин. К надосадочной жидкости добавляют хло" ристый натрий из расчета 20 мг на пробу и помещают на 18 ч в холодиль 1 1301409Изобретение относится к медицине и ветеринарии и может быть использовано для производства диагностических и лечебных сывороток.Цель изобретения - пролонгирование повышенных титров антител.П р и м е р 1, Для получения вирусосодержащей жидкости используют 1 О-дневные куриные эмбрионы в аллантоисную полость которых вводят 10 по 0,2 мл аллантоисной культуры вируса гриппа А (Гонконг/1)68(Н 3112) в-эразведении 1 Р -10 . Эмбрионы после заражения инкубируют 48 ч в термостате при 36-38 С. По истечении срока 15 инкубации эмбрионы охлаждают 18 чпри 4 С или 2-3 ч при -2 Р С. Аллантоисную жидкость из зараженных куриных эмбрионов отсасывают и исследуют в реакции гемагглютинации с 20 17-ной взвесью эритроцитов кур, Для этого готовят двукратные падающие разведения вируса на Физиологическом растворе хлористого натрия в объеме 0,2 мл и после этого в каждое разведение добавляют по 0,2 мл 0,1 Е-ной взвеси эритроцитов кур. Реакцию ведут при комнатной температуре и учитывают после полного оседания эритроцитов. За титр вируса 30 принимают наибольшие разведения, дающие четко выраженную агглютинацию.Аллантоисную вирусосодержащую жидкость центрифугируют на холоду в 35 центрифуге ЦЛРпри 5000 об/мин 20 мин для удаления механических примесей, Осадок отбрасывают, а надосадок центрифугируют на холоду в центрифуге ЦВРпри 20000 об/мин 401,5 ч, чем достигают концентрирова-ние вируса, надосадочную жидкость удаляют, а осадок ресуспендируют в охлажденном Физиологическом растворе и разводят до титра 1:8000-1:45:16000 ГА/0,2 мл.Очистку вирусной суспензии проводят методом Фильтрационной хроматографии на колонках с макропористымсилохромом (МПС).Колонку с МПС (16 см2 см) промывают 0,05 М трис-НС 1-бстфером (три-оксиметил-аминометан) на 0,15 М растворе хлористого натрия (рН буФера 7,2-7,4) до тех пор пока выходящая из колонки жидкость не соответствует этому значению рН. Уровень буфера в колонке уравнивают по нижнему мениску с уровнем МПС. Ви1301409 4При этом титры антигемагглютиниов на 21-42 дни в 2,5-5,7 раз выше, ем при известном способе.П р и м е р 6. Последовательность ыполнения операций аналогична приеру 1. Невозможно осуществлять спооб при весовом соотношении трипсин: :поливинилпирролидон 2,7 мг:4,05 мг (1:1,5).Увеличивать количество поливиилпирролидона больше соотношения 1:20 нецелесообразно из-за вязкости бразующегося раствора.П р и м е р 7. Последовательность ыполнения операций аналогична приеру 1, Осуществляют способ при исользовании полиэтиленгликоля. Весовое соотношение трипсин:полиэтиленгликоль 2,7 мг:5,4 мг (1:2), На28, 35, 42 дни наблюдения титры антигемагглютининов в опытной группесоответственно в 2,6-10,6 раз зьппе,чем при известном способе,П р и м е р 8. Последовательностьвыполнения операций аналогична примеру 1. Осуществляют способ при весовом соотношении трипсин:полиэтиленгликоль 2,7 мг;54 мг (1:20), На28, 35; 42 дни наблюдения титры антигемагглютининов в опытной группесоответственно в 3, 12, 1 раз вьппе,чем при известном способе,П р и м е р 9. Последовательность выполнения операций аналогична примеру 1, Невозможно осуществлять способ при весовом соотношении трипсин:полиэтиленгликоль 2,7 мг:4,05 мг (1:1,5) . Увеличивать количество полиэтиленгликоля больше нецелесообразно из-за увеличения вязкости раствора,Таким образом, предлагаемый способ получения противогриппозных антител дозволяет повысить титры специфических антител в сыворотках крови животных-продуцентов в .2-12 раз, причем на более длительных сроках после иммунизации (28-42 дни) наблюдается увеличение титров антител в 3-12 раз. Это позволяет увеличить сроки использования животных и при этом получать более высокотитражные сыворотки, и может быть использовано для производства диагностических и лечебных препаратов, а также в практике научных исследований. 3ник. Надосадочную жидкость послецентрифугирования используют длянпостановки РТГА, для чего применя- чют микротитратор "Такат"Двукратное разведение сыворотки 5 вготовят на 0,15 М растворе хлористо- м:го натрия перекаткой петлями объемом с/0,025 мл. Рабочее разведение одноименного вируса А(Гонконг/1)68 содержит четыре гемагглютинирующие еди-Яницы. К каждому разведению сыворотки ндобавляют равный объем рабочего разведения вируса. Смесь встряхиваютои 30 мин выдерживают при комнатнойтемпературе, а затем в лунки добавлявют двойной объем 0 57-ной взвеси ку- мОриных эритроцитов,Из полученныхпрезультатов рассчитывают средние гео-,метрические титры антител и достоверность различий, Они свидетельству ют о том, что в более поздние срокинаблюдения (на 28-42 дни) средниегеометрические значения антигемагглютинирующей активности в опытнойгруппе в 2, 8, 7, 5 раз вьппе, чемпри известном способе.П р и м е р 2. Последовательностьвыполнения операций аналогична примеру 1. Осуществляют способ привесовом соотношении трипсин;поливиниловый спирт 2,7 мг;54 мг (1:20).При этом титр антигемагглютининов на28-42 дни в опытной группе в 3,2-9,2раз вьппе, чем при известном способе.П р и м е р 3. Последовательностьвыполнения операций аналогична примеру 1. Осуществляют способ при весовом соотношении трипсин:поливиниловый спирт 2,7 мг:4,05 мг (1:1,5).Увеличивать количество поливинилового спирта больше соотношения1:20 нецелесообразно. из-за вязкостиобразующегося раствора.П р и м е р 4. Последовательностьвыполнения операций аналогична при 45меру 1, Осуществляют способ при использовании поливинилпирролидона,Весовое соотношение трипсин;поливинилпирролидон 2,7 мг:5,4 мг (1:2).Титры антигемагглютининов на 2842 дни в опытной группе в 2,610,6 раз выше, чем при известном способе,П р и м е р 5. Последовательностьвыполнения операций аналогична примеру 1. Осуществляют способ при использовании поливинилпирролидона,Весовое соотношение трипсин:поли-.винилпирролидон 2,7 мг:54 мг (1:20)5 1301409 Формула изобретения1. Способ получения противогриппозных антител путем иммунизации животных инактивированным вирусом гриппа, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью пролонгирования повыщенных титров антител, иммунизацию вирусом осуществляют совместно с раствором, содержащим трипсин и водорастворимый полимер при весовом соотнощении соответственно 1;2-1:20.2, Способ по и, 1, о т л и ч аю щ и й с я тем, что в качестве водорастворимого полимера используют поливиниловый спирт, поливинилпирролидон или полиэтиленгликоль. Составитель П,Бонарцев Редактор И.Горная Техред М.Ходанич Корректор С.ШекмарЗаказ 1172/4 Тираж 596 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5