Способ получения липоарабиноманнана, обладающего противоопухолевой активностью

,8012 2124 АЗ 4 А 61 К 35/66 ИЯ ИСАНИЕ ИЗОБРЕ К ПАТЕНТУ 943651/28-14-54-84681/794.07.79 Бюл. У 1 а (ТР) .8)У 48-43842, 6(46), 1973. ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИИ(54) (57) 1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИПОАРА БИНОИАННАНА, ОБЛАДАКЗЦЕГО ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТЬЮ, эаключакицийся в том, что биомассу МусоЬасгегц 1 в иЬегсц 1 оэ 1 э штамма Аоуаша или Н,К 7Ру экстрагируют водой при 100 С с последующим выделением и очисткой целевого продукта,2, Способ по п.1, о т л и ч а ю - щ и й с я тем, что, с целью повыпения иммунологической активности целевого продукта, последний этерифицируют жирной кислотой, например пальмитиновой.35 50 12321Изобретение относится к медицине и касается получения лекарственного препарата.Целью изобретения является получение липоарабинаманнана, обладающего противоопухолевой активностью, а также павьппение иммунологической активности целевого продукта.Способ иллюстрируется следующими примерами, 1 ОП р и м е р 1. Саутон среду засевают МусаЬасьег 1 итп гаЬегси 1 оздз штаммом Аауаша и аэрабное культивирование продолжается 14 дн. Клеточные тела отделяют Фильтрацией и 15 промывают холодной надай, после чего добавляют дистиллированную воду для флатиравания (всплывания) клеток в воде. Клеточную взвесь нагревают при 100 С в течение 120 мин и фильт- р 0 руют с получением водного раствора экстракта клеточных тел. К раствору добавляют сульфосалициловую кислоту для осаждения белкового компонента, после чего раствор подвергают цент рифугираванию для его разделения, Супернатант диализуют с использованием диализной мембраны, полученную жидкость смешивают с 9 частями по объему этилового алкоголя, получен- З 0 ную смесь разделяют центрифугированием и затем отделяют осажденный сырой липапалисахарид. Сырой липополисахарид загружают в колонку, набитую ДЕЛЕ-СефадексомА(бикарбанатная форма) и собирают фракцию, элюированную дистиллированной водой. Эту Фракцию концентрируют, перемешивают с. равным количеством этилового алкоголя и смесь разделяют центрифугированием. Супернатант концентрируют и просеивают путем молекулярного просеивания согласно высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием колонки, набитой ТБК Се 1 4000 БУ, ТБК Се 1 30 Г)0 БИ и ТБК Се 1 2000 БМ, при этом собирают Фракцию с молекулярным весом от 10000 да 160000. Эту фракцию диализуют, концентрируют и затем очищают аффинной хроматографией,. с использованием конкавалин А-связанной агарозы с получением очищенного липапалисахарида. Липополисахарид состс, -ит из 617 арабинозы, 387, маниозы и17 глюкозы, содержит жирные кислоты:метил лаурат, метил миристат, метидпальмитат, метил гентадеканоат, метил 24 2стеарат, метил алеат, метил туберкулостеарат (всего 150,7 мкг),Структура сахаридной цепи представлена в табл. 1.П р и м е р 2. МусоЬасгег 1 ишгчЬегси 1 оз 1 з штамм Н, К культивируют и затем обрабатывают биомассусогласно примеру 1, После очисткиполучают липаполисахарид, состоящийиз 567. арабинозы и 447. манназы; содержит жирные кислоты: метил лаурат,метил миристат, метил пальмитат,метил гептадеканоат, метил стеарат,метил туберкулостеарат (всега79,6 мкг).Структура сахаридной цепи представлена в табл. 2.П р и м е р 3, Способ получениялипоарабиноманнана из безлипидногоарабиноманнана.Биомассу, полученную по примеру1, экстрагируют щелочью 1 н. ИаОНпри комнатной температуре и путеммолекулярного просеивания получаютарабиноманнан с молекулярным весомот 8500 до 14000. Полученный арабино -маннан далее очищают афинной хроматографией, высушивают и 10 мг сухогоарабиноманнана, вводят в реакцию с10 мг пальмитинового ангидрида при50 С в течение 20 ч в И,И-диметилформамидпириридин, К реакционнойсмеси добавляют этиловый эфир и осадок отделяют центрифугированием, промывают этиловым эфиром, высушивают сполучением 11 мг липоарабиноманнана.Структура сахаридной цепи аналогична препарату по примеру 1. Пальмитиновая кислота связана в основномпо 5 положению арабинозной единицыв цепи арабинаманнана в количестве9,8 вес.7. и средний молекулярныйвес - более 12500. П р и м е р 4, Биомассу, полученную по примеру 2, экстрагируют щелочью 1 н. ИаОН при комнатной температуре, подвергают очистке арабиноманнан согласно примеру 3. 10 г сухого арабиноманнана вводят в реакциюос 8 мл пальмитолхлорида при 37 С втечение 16 ч используя в качестве растворителя смесь пиридина с Б,И-диметилформамидом, К реакционной смесидобавляют этанол и отделяют образующийся осадок центрифугированием,промывают его этиловым эфиром и сушат, получая в результате 10 мг липоарабиноманнана,3 12Структура сахаридной цепи вещества аналогична веществу, полученному по примеру 2. Пальмитиновая кислота связана в основном со звеном арабиноэы в цепи арабиноманнанан в положении 5 в количестве около 7,6 вес.7. и средний молекулярный вес составляет 12000.П р и м е р 5. 5 мг арабиноманнана, содержание жирной кислоты в котором около 37 и который получен способом, аналогичным примеру 1, обрабатывают ультразвуком с 10 мг пальмитоилхлорида в пиридине и реакцию проводят при 37 С в течение 18 ч. К реакционной смеси добавляют этиловый спирт, осадок собирают,промывают этиловым эфиром и высушивают с получением 4,3 мг липоарабиноманнана.Анализ показывает, что пальмитиновая кислота связана в основном по 5 положению арабинозной единицы и 6 положению маннозной единицы в цепи арабиноманнана в количестве около 28 вес.7 и средний молекулярный вес около 14000. Липоарабиноманн, полученный поВпримерам 3 и 5,может быть получен также при использовании безлипидного или низколипидного арабиноманнана, экстрагированного и очищенного из клеточных тел МусоЬасгегщп гцЬегсы - 1 оздз штамма Нз Кч, Кроме того,вмесЗ 7 Индикаторная связь Отнош метил"метил"манноза Мавр) 12,8 100 Общ 2,Э,5-Три-О-метил-арабиноза2,Э-Ди"0-метил-арабн- ноза 32124 4 то пальмитиновой кислоты по примерам 3 и 5 может быть использована стеариновая кислота,Следующие примеры иллюстрируютпротивоопухолевую активность арабиноманнана,П р и м е р 6. Клетки (1 х 10 ) опухоли Саркомыподкожно трансплантируют Ы У мьппам (самки, возрастО 10 нед.), которые были сенсибилизированы ВСС. Начиная со следующегодня, липоарабиноманнан, растворенныйстерильно в физиологическом растворе,вводят подкожно группам мьппей (каждая15 группа состоит из 8 мьнпей) в количестве от 0,2 до 2,0 мкг на каждую мьппьчерез день 8 раз в целом, Через 30 дн.после трансплантации опухолевых клеток тестируемых животных забивают и20 измеряют вес опухоли, Противоопухолевую активность каждого липоарабиноманнана оценивают на основе измерениявеса опухоли. Раствор для инъекции готовят следующим образом.25 1 мг липополисахарида растворяютв соответствующем количестве физиологического раствора для инъекцийс образованием 100 мп раствора, Раствор готовят в виде формы для подкожных инъекций, содержащей 10 мкг/мплипополисахарида. Этот раствор вводят подкожно 1-3 раза (10-30 мкг липополисахарида) в неделю.Побочных эффектов при использовании препарата не наблюдается,35 Таблнца 11232124 Таблица 2 Индикаторная связь Обнаруженный сахарид 2,3,5-Три-О-метил-П-арабиноза 3,0- (Агаг) 1 --0,9 41,5 12,4 55,57+ -- (Мапр) 1 9,4 2,8 3,4,6-Три-О-метил-П-маннозав -2(Мапр) 1 л 9,0 2,744,5 Ж 17,7 5,3 8,4 1 ОО 29,9 Общее Составитель Г. СмирноваТехред В.Кадар Корректор СЧерни Редактор Ю. Середа Заказ 2664/60 Тираж 660 ПодписноеВНИИПИ оосударственпого комитета СССРпо делам изобретений и открытий13035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород,ул. Проектная, 4 2,3-Ди-метил-П-арабиноза ф - 5(Агаг) 1 3,5-Ди-метил-П-арабиноза + - 2(АгаЕ) 1 2,3,4-Три-О-метил-П-манноза - 6(Мапр) 1 3,4-Ди-О-метил-П-манноза -26(Мапр) 1 Отношение к 2-0- Содержание,7.метил-арабинозе