Способ получения нуклеазы

19) О) СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИК 1)С 2 2 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР Г О ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИ Е ИЗОБРЕТЕВИДЕТЕЛЬСТВУ АВТОРСН(56) 1. Абрамов Р.Е., Безирджан Х,О.,Акопян Ж.И., Нуклеаза из АзрегЕПцяогукае специфическая к однонитьевымучасткам .нуклеиновых кислот. " "Био химия", 1979; т. 44, Ф 6, с.990-995." 2. Сенченко В.И., Колбановская Е.О., Бочаров А.А. Получение .инекоторые характеристики функционально гомогенного препарата нуклеазыБиз амилоризина. - "Мол.Биология",1979, т. 13, У 6, с. 1377-1383.(54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ81 из амилоризина, включэкстракции, термообработкнннрования сульфатом. аммонхроматографии на диэтилами НУКЛЕАЗЫ ающий стадиифракциоия, диализа,ноэтилцелОПИСАНИ люлозе, Концентрирования, гель-фильтрации на сефадексе Ги повторного концентрирования, о т л и ч а ю - щ и й с я тем, что, с целью увеличения чистоты целевого продукта и уп" рощения способа, после диализа раствор нуклеазы депигментируют активированным углем, нри храиатографии на диэтиламиноэтилцеллюлозе сорбцию осуществляют в 0,05-0,075 И ацетата ам" мония с рй 5,2-5,6, а десорбцию осуществляют ацетатом аммония сначала с удельной электропроводностью (12-14)н н 10 см м для отделения балластных белков, а затем с электропроводнос 4тью (23-30) 10 см и для элюции нуклеазы, концентрирование проводят ультрафнльтрацией через мембрану из сополимера метилметакрилата и 4-винилпиролидона с радиусом пор 50- 150 мкм, а повторное концентрирова" . ние - диализом против 5-603-ного раствора глицерина.аминоэтилцеллюлозе сорбцию осуществляют в 0,05-0,075 И ацетате аммонияс рН 5,2-5,6, а десорбцию осуществляют ацетатом аммония сначала с удельной электропроводностью (12-14)х 10 см мдля отделения балластныхбелков, а затем с электропроводностью (23-30) 10 см м " для элюцийнуклеазы, концентрирование проводятО ультрафиль,рацией через мембрану изсополимера метилметакрилата и Н-винилпиролидона с радиусом пор 50150 мкм, а повторное концентрирование - диалиэом против 45-60 .-ного13 раствора глицерина.Сущность способа заключается вследующем.Амилоризин зкстрагируют буферомацетата натрия рН 4,6 и экстракт20 подвергают термообработке при 70 фС,проводят осаждение сульфатом аммония при 70 и 100 насыщения, осадокрастворяют, диализируют и проводятдепигментацию активированным углем,2 очистку нуклеазы Б продолжают сорбцией на ДЭАЭ-целлюлозе в стационарном режиме в буфере ацетата аммониярН 5,2"5,6 и злюцией буферами повышенной ионной силы с удельной электропроводимостью (12"14)10 см.м ,(23-30) 10смм , Концентрируютраствор фильтрацией через мембрану Ринор с радиусом пор 50"150 мкм,хроматографируют на сефадексе Г,и.конечный продукт стабилизируютдиализом против 45-60 .-ного раствораглицерина,1 11615Изобретение относится к молекулярной биологии, а именно к способу по"лучения нуклеазы Я (КФ 3.1,30.1, одноцепочной нуклеинат-олигонуклеотид-гидролазы), применяемой в молекулярной биологии при изучении первичной структуры дезоксирибонуклеиновых кислот и рибонуклеиновых кислот. Фермент также применяется в генетической инженерии при получениирекомбинатных ДНК,Известен способ получения нуклеа-,зы Б, основанный на использованииионообменной хроматографии на ДЭАЭцеллюлозе . И .Однако из-за недостаточной очистки препарат содержит примесь другихферментов.Наиболее близким к предлагаемомупо технической сущности и достигае-,мому положительному эффекту является способ получения нуклеазы Зу иэ, амилоризина, включаеций стадии экстракции, термообработки, фракциониронания сульфатом аммония, диалиэа, хроматографии на диэтиламиноэтилцеллюлозе, концентрирования, гельфильтрации на сефадексе Ги повторного концентрирования, причемконцентрирование приводится с помощью хроматографии на ДЭ(3-кратной), Способ включает также стадиюхроматографии на сульфо-сефадексе 121.Недостатками способа являются егосложность (16 стадий, причем 6 изних - хроматография на ионообменни"ках), использование импортных сор"бентов (ДЭфирмы "Ватман", сульфосефадекс и сефадекс Гфирмы"Рагшасха"), а также неполное отде" ф 1ление от загрязняющих целевой продукт ферментов. 1Цель изобретения " увеличение чистоты целевого продукта и упроще" 45 ние способа.Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения нуклеазы Я. из амилоризина, включающему стадии экстракцни, термообра- Я ботки, фракционирования сульфатом аммония диализа, хроматографии на дяэтиламиноэтилцеллзаоэе концентрирования, гель"фильтрацйи на сефадексе Ги повторного концейтри- Я рования, после диализа раствор нук" леазы депигментируют активированньк углем, при хроматографии иа диэтил 50 г В результате отделяется основнаямасса пигмента и связанного с ним белка. Удельная активность при этомповышается в 1,5-3 раза. Удалениениэкомолекулярных белков позволяетболее эффективно проводить хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе и экономить материалы, в том числе ДЭАЭ-целлюлозу. На том же количестве ДЭАЭ-целлюлозы и сефадекса Гможно осуществить разделение в 1,5-3 раза большихколичеств фермента,Сорбцию Я проводят на ДЭАЭ"целлюлозе, уравновешенной 0,05-0,075 буферои ацетата аммония рН 5,2-5,б, что позволяет получить более хорошее , отделение примесей РНКаз. Использованне буфера ацетата аммония посравнению с буфером ацетата натриявызывает улучшенное разделение бел3 11615 конон смеси и способствует получению нуклеазы Я высокого качества.Концентрирование образцов ультра- фильтрацией обеспечивает дополнительную очистку (отделение низкомолеку лярных веществ), при этом активность нуклеазы Б сохраняется на 80-1007 и из процесса очистки исключается диализ нли разбавление раствора с целью получения раствора с более низкой О электропроводностью, необходимое для сорбции на анионитах.Концентрирование образцов диализом против 45-507.-ного раствора глицерина позволяет обеспечить процесс 15 концентрирования и стабилизацию препаратов нуклеазы Я. Объем раствора нуклеазы Б снижается в 2-3 раза.Упрощение процесса достигается включением в технологию очистки ста дий, позволяющих улучшить контроль процесса н ускорить проведение отдельных стадий очистки.Замена стадий концентрирования на ДЭ-целлюлозы концентрировани ем на ультрафильтрах и диализом против глицерина, а также исключение хроматографии на сульфо-сефадексе , позволяет сократить число стадий с 16 до 14. В результате получают пре- ЗО парат с удельной активностью 20,000- 70.0 дО ед/мг белка, выход 173, практически не содержащий примеси нееспецифических фосфатаз, Фосфодиэстераз и экзонуклеаз. П р и м е р 1. 160 г амилоризина экстрагируют 1,6 л 0,02 М буфера ацетата натрия, содержащим 0;05 М ЮаС 1 и 0,1 мМ Е и+ . Осадок отделяют центрифугированием. Экстракт подвер б гают термообработке, постепенно повышая температуру раствора до 70 С в водяной бане с температурой 75 ОС. К раствору добавляют сульфат аммония до насыщения 0,7 (800 г),перемеши вают и осадок отделяют центрифугиро" ванием. К центрифугату добавляют 320 г сульфата аммония (насыщение 1,0) и после формирования осадка отделяют осадок центрифугированием, 50 растворяют и проводят диализ против деминерализоваиной воды. К диализату добавляют ЗЕ по объему активированного угля и перемешивают 30-40 минопри 4 С. Уголь удаляют Фильтрацией 55 через ватный порошок и разбавляют в 2 раза 0,05 М буферным раствором уксуснокислого аммония рН 5,2, содер 50 4жащего 0,1 мИ ионов цинка. К раствору добавляют ДЭАЭ-целлюлоз- (1 г на 100 мг белка) и перемешивают 20 мпн, ДЭАЭ-целлюлозу отделяют фильтрацией, суспендируют в 0,05 И буфере ацетата аммония рН 5,2 и переносят в колонку (4 25 см), Колонку промывают раствором ацетата аммония рН 5,2 с удельной электропроводностью 121 Г см.м и фермент элюируют буферным раствором ацетата аммония рН 5,2, содержащего 0,1 мМ ионов цинка с удельной электропроводимостью 23 10 см.м .Раствор нуклеазы Б фильтруют череэ мембрану Рипорс радиусом пор 50-100 мкм до объема 20 мл и наносят на колонку с сефадексом Г(4 х 100 см), уравновешенной буфером ацетата натрия рН 4,6, содержащего 0,1 мИ ионов цинка. Активные фракции объединяют и двухкратно диализируют при постоянном перемешивании при 44 С в течение 1 ч против 503- ного раствора глицерина (соотношение диализируемого раствора и диализирующего раствора - 1: 10 по объему).Достигается 3-кратное концентри рование раствора и стабилизация нуклеаэы в растворе 507.-ного глицерина. В результате получают препарат нуклеаза Б с активностью 10000 ед/мл, удельйой активностью 30.000 ед/мг белка, фермент при проверке вызывает расщепление суйерспиральной ДНК плаз-, миды рВК 322 и образование кольцевой и линейной формы ДНК. На электрофо" реграмме не наблюдаются размытые зоны продуктов расщепления ДНК, появление которых свидетельствует о наличии примесей эндонуклеаз. Выход составляет 173, Препарат нуклеазы 8 также не содержит примесей неспецифических: Фосфатазы и фосфодиэкстераэы (субстраты и-нитрофенилфосфат и кальциевая соль бис"п-.нитрофенилфосфат).Активность нуклеазы 8, определена по расщеплению ферментом денату" рированной ДИК при рН 4,6. Заединицу активности принимают количество фермента, которое катализирует гид 1 ролиз 1 Мг денатирурованной дезоксирибонуклеиновой кислоты за 1 мин при 37 С и рН 4,6. П р и м е р 2. 0,7 кг амилоризи-на экстрагируют 7 л буфера ацетатанатрия, проводят термообработку, вЫсаливание сульфатом аммония, диализВНИИИИ Заказ 3938/31 Тираж 525 ПодписыоеЭЮЮВФВФФЮЮЮВЮФР Фипыай ПОП Яйжтеатф, г.Увгород, ул,Проектная, 45 11615 ,и депигментацию, как в примере 1, К " раствору, полученному при депигментации добавляют ДЗАЭ-целлюлозу (волокнистую), уравновешенную : 0,075 М буфером ацетата аммония рН 3 5,6, перемешивают и переносят в колонку (1025 см), как описано в примере 1. Злюцию проводят буфером ацетата аммония, содержащим 0,1 мИ ионов цинка и удельную электропро водимость 14 х 10 см,м 1 и буфером с электропроводимостью 30 10 см,м ".Активные фракции объединяют и концентрируют ультрафильтрацией через мембрану Рипор(радиус пор 100- 15 150 мкм) до объема 100 мп, наносят по порциям 20 мл на колонку с сефадексом Ги проводят хроматогра" фию, как описано в примере 1. Активные Фракции объединяют и проводят 26 концентрирование раствора диализом против 607-ного глицерина, как опи" сано в примере 1. В результате получают 200 мл раствора нуклеазы 8 в 60 Е-ном растворе глицерина с ак- И тивностью 21.000 ед/мл и удельной активностью 53.300 ед/мл. Выход составляет 20% по активности.П р и м е р 3. 0,16 кг амилоризина экстрагируют 1,6 л буфера аце- щ тата натрия, проводят термообработку, высаливание сульфатом аммония, диалиэ н депигментацию, как в примере 1. К раствору, получейному при депигментации, добавляют ДЭАЭ-целлю-,лозу, уравновешенную 0,055 И буфером ацетата аммония рН 5,5, промывают и переносят в колонку, как описано в примере 1. Злюнруют колонку буфером ацетата аммония, содержащим 0,1 мМ р ионы цинка, с удельной злектропроводностью 1310 см,м "и 2710 см.м 1. Активные Фракции объединяют и проводят ультрафильтрацию и гель-хромато" графию, как описано в примере 1. Раствор нуклеаэы 8, полученный при гель- хроматографии, концентрируют диализом против 5 ОЕ-ного раствора глицерина в буфере. В результате получают 12 мл раствора 8 с активностью 31.000 ед/мл и удельной активностью 50 670.000 ед/мг белка. Выход по активности составляет 213.П р им е р 4, 0,16 кг амилоризина экстрагируют 0,16 л буфера ацетата натрия и проводят термообработку, высаливание сульфатом аммония, диализ, депигментацню, хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе, ультрафильтрацию и хроматографию на сефадексе Г, как в примере 1. Активные фракции, полученные при гель-фильтрации 1(60 мл), диализируют двухкратно при постоянном перемешиванин против 45%-ного раствора глицерина. В ре" зультате получают 28 мл раствора нуклеазы 8 с активностью 18.000 ед/мл, удельной активностью 27.000 ед/мг и выходом 203. При проведении хроматографии при концентрации солей ниже 0,05 М рН 5,2"5,6 наблюдается снижение стабильности фермента, а при концентрации выше 0,1 И часть фермента при рН 5,2-5,6 не сорбнруется, Значение рН 5,2-5,6 при хроматографии на ДЗАЭ-целйюлозе обеспечивает высокую степень очистки, выход фермента и максимальное отделение прнмесных РНКаэ. При рН 5,0 снижается эффективность сорбции нуклеаэы, а при рН 5,9 и 7,0 в соответственно в 1,5 и 2,0 возрастает количество примеси РНКаз после хроматографии,Таким образом, изобретение обеспечивает получение препарата нуклеаэы 8 высокого качества эа счет увеличения его чистоты, а также упрощение способа за счет сокращения чис" ф ла стадий с 16 до 14 и облегчения проведения хроматографии и контроля за ней путем введения ступенчатой злюции фермента, Кроме того, способ позволяет получать Фермент без использования импортной ДЭАЭ-целлюлозы фирмы "Ватман".Себестоимость препарата составляет О, 18 р. за 1000 ед. активности по сравнению с 0,82 р. за препарат, выпускаемый.на НПО "Биохимреактив",Препарат по качеству соответствует препаратам Фирмы 8 х 8 ша, Р-Ь ВдосЬещаса 1 в и др.