Способ получения стимулятора из селезенки млекопитающих

(51) А 61 К 35/2 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯМ АВТ У А ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР пО делАм изоБРетений и ОтнРыти ОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(71) Ленинградское производственнообъединение мясной промышленностиим. С,М.Кирова(56) Авторское свидетельство СССРУ 839090,кл. А 61 К 35/28,1979 (пртотип).(54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СТИМУЛЯТ ИЗ СЕЛЕЗЕНКИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ, включающий обработку органа ацетоном,его измельчение, получение надосадоч"ной жидкости, обработку ее ацетономс последующимотделением осадка,его экстракцией и лиофилизацией,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что,с целью повышения иммуностимулирующей активности, измельченную селезенку экстрагируют в ЗХ-ном раствореуксусной кислоты при рН3,0-4О,в присутствии хлористого цинка, аосадок, полученный после обработкиэкстракта ацетоном, экстрагируют водой в присутствии уксусной кислотыпри рН 6,0-7,0 с последующим фильтрованием и лиофилизацией.Изобретение относится к медицинс.кой промышленности и может быть использовано для иммуностимуляции организма,Цель изобретения - повышение иммуностимулирующей активности,Цель достигается тем, что согласно способу получения стимулятора изселезенки млекопитающих, включающемуобработку органа ацетоном, его из Омельчение, получение надосадочнойжидкости, обработку ее ацетономс последующим отделением осадка, егоэкстракцией и лиофилизацией, измельченную селезенку экстрагируют в ЗХном растворе уксусной кислоты прирН = 3,0-4,0 с добавлением хлористого цинка, а осадок, полученный послеобработки экстракта ацетоном, экстра.гируют водой в присутствии уксусной 20кислоты при рН 6,0-7,0 с последующимфильтрованием и лиофилизацией.Переработка путем зкстрагирования измельченной селезенки в 37-ном растворе уксусной кислоты позволяет произвести гидролиз крупных белков , и других высокомолекулярных соединений, что способствует лучшей очист" ке и устранению пирогенности, Добав ление хлористого цинка способствует полному выделению из селезенки конечного продукта и лучшему осаждению его ацетоном. Экстракция осадка в воде при определенном рН (экстр- агент - раствор уксусной кислоты) способствует растворению в воде наиболее активных веществ и позволяет отделить от них нерастворимые балластные вещества путем фильтрации, Отклонение от заданных пределов кис 40 лотности приводит к потере активного вещества.Существующие известные решения не имеют свойств, присущих предложенному. Концентрация спиртовой фракции, концентрация диализата приводит к разрушению специфического начала вещества в результате гидро лиза. Предложенное в известных спо собах отделение балластных веществ происходит за длительный период и малоэффективно, Отделение сопутствую щих веществ ведет к потерям. Способ-, прототип, взятый за базовый объект, 55 позволяет получить вещество, которое ингибирует синтез ДНК, но не оказывает стимулирующего действия на лимфоциты и активные Т-лимфоциты селезенки,П р и м е р 1, Берут селезенкукрупного рогатого скота, промываютводой, Селезенку помещают в ацетон,берут 1 часть селезенки и 1 О частейеацетона с температурой -5 С. Через24 ч ацетон сливают, а селезенку0,5 кг измельчают и помещают в реактор с мешалкой. Измельченную селезенку заливают 5 л раствора ЗЕ-нойуксусной кислоты при рН = 3,0, добавляют 0,005 кг хлористого цинкаи экстрагируют 36 ч, перемешиваяч через каждые 8 ч, По окончанииэкстракции субстрата сливают и центрифугируют 15 мин со скоростью3000 об/мин, надосадочную жидкостьдекантируют, к ней добавляют 6 частей ацетона на 1 часть жидкости,перемешивают и формуют осадок 20 ч.Выпавший осадок высушивают на фильтре, измельчают и растворяют 0,01 кгв 0,5 л воды с добавлением уксусной кислоты до рН=7,0. В течение 2 ч непрерывно перемешивают и удаляют балластные вещества путем фильтрации. Полученный раствор стерильнофильтруют через пластины ЕК 8, разливают во флаконы так, чтобы в каждом содержалось 10 мг вещества и лиофилизируют, Выход активного вещества 0,005 кг.П р и м е р 2, Берут селезенку животных, промывают водой и ацетоном, помещают 1 часть селезенки в 10 частей ацетона с температуройо-5 С. Через 24 ч ацетон сливают, 10 кг селезенки измельчают на волчке, помещают в реактор и заливают 100 л раствора уксусной кислоты до рН = 4,0, добавляют 0,1 кг хлористого цинка и экстрагируют 36 ч, перемешивая непрерывно по часу через каждые 8 ч. По окончании экстракции субстрат сливают и центрифугируют 15 мин со скоростью 3000 об/мин, надосадочную жидкость декантируют, к ней добавляют 6 частей ацетона на 1 часть жидкости, перемешивают и фор мируют осадок 20 ч, Выпавший осадок высушивают на фильтре, измельчают и растворяют 0,2 кг осадка в 10 л воды с добавлением уксусной кислоты до рН = 6,0, В течение 2 ч перемешивают и удаляют балластные вещества фильтрацией, Отфильтрованный раствор. стерильно фильтруют через пластины11"В 20 циты являются иммунокомпетентнымиклетками,ФУстановлено, что введение вещества, полученного из селезенки по пред.ложенному способу приводит к значительному увеличению лимфоцитов и1 11активных Т-лимфоцитов в селезенке.Все остальные вещества, полученныеизвестными способами подобной актив 0 ностью не обладали.При физико-химическом анализе выделенного из селезенки вещества устанбвлено, что оно представляет собой комплекс полипептидов. Изучениетоксичности и аллергизирующих свойстввыделенного вещества на животных показало, что препарат иэ селезенкине обладает в терапевтических дозахподобной активностью. Это указываетна перспективность препарата иэ селезенки для применения. в медицинской практике,Эксперименты, проведенные на животных, указывают на тканеспециическую стимуляцию иммунокомпетентныхклеток в селезенке под воздействием.вещества, выделенного из этого жеоргана, Это явление может быть использовано для создания лекарственного препарата с целью стимуляцииактивности клеток селезенки, где,как известно, происходит образование и функционирование антителообразующих клеток после появления антигенов в организме, Известно, чтоприменение различных цитостатическихсредств, ионизирующей радиации, глюкокортикоидов приводит к резкому подавлению иммуногенеэа. Поэтому применение в этих случаях препарата иэселезенки является целесообразным иполезным. ЕК 5, разливают во фпаконы так, чтобыв каждом содержалось 1 О мг веществаи лиофилиэируют, Получают 0,1 кг активного вещества из 1 О кг сырья.П р и м е р 3, Берут свиную селезенку, промывают, помещают в ацетон с температурой -5 С, выдерживаоют сутки, сливают ацетон, Беруткгселезенки, измельчают и экстрагируютв 10 л З -ного раствора уксусной кис. 1лоты при рН = 3,5. Добавляют 0,01 кгхлористого цинка, экстрагируют 36 чпопеременно перемешивая, По окончании экстракции субстрат сливают,центрифугируют, надосадочную жидкостьдекантируют,к ней добавляют 6 частейацетона на 1 часть жидкости,перемешивают и формируют осадок за 20 ч,Полученный осадок высушивают и измельчают, Осадок в количестве 0,02 кг раст воряют в 1 л воды с добавлением уксусной кислоты до рН = 6,5, перемешивают и удаляют балластные веществафильтрацией, Раствор стерильно фильт"руют и разливают во флаконы по 10 мг 25вещества, лиофилизируют, Выход активного вешества из исходного сырьясоставляет 0,01 кг,Биологическую активность вещества9выделенного из селезенки, оценивали 30по показателям иммунитета экспериментальных животных,Эксперименты проводили на 50-ти морских свинках, самцах весом 200- 250 г, Животные были разделены на 35 5 равных групп: контрольную и подопытные. Подопытным животным вводили по 0,1 мг рекомендуемая для людей терапевтическая доза) активных веществ, выделенных из селезенки раз. 40 личными способами, растворенных в 0,5 мл физиологического раствора, Вещества вводили ежедневно внутримышечно в течение 20 дней, Контрольным животным по аналогичной схеме 45 вводили по 0,5 мл физиологического раствора, На 21-е сутки всех. животных забивали, выделяли селезенку и лимфатические узлы. Ткань селезенки и лимфатических узлов гомогениэи ровали, выделяли клетки и затем определяли удельную концентрацию лимфоцнтов (удельная концентрация - количество. клеток в тысячах на 1 мг ткани) и "активных" Т-лимфоцнтов ме тодом спонтанного роэеткообразования с эритроцитами кролика. Известно, что лимфоциты и "активные" Т -лимфоДля получения вещества предложенным спосббом имеется в достаточном количестве сырье.Известно, что в селезенке присутствуют лимфоциты антителообразующие клетки), которые осуществляют выработку антител на различные антигены. Однако выработка антител лимфоцитами селезенки на ряд антигенов недостаточна. Поэтому применение веществаЭ увеличивающего количество клеток в селезенке, позволяет увеличить образование и выход антител.Проведены эксперименты, подтверждающие высокую эффективность препарата в отношении стимуляции антител" Статистически достоверно по сравнен контролем (Р П.Вонарце за Составитель Техред С.Ле ктор В.Ковт Корректор О.Билак Заказ 3427/ Тираж 72Государствелам изобрква, Ж,Подписи ВНИИПИ п 113035, нного комитета СССР ений и открытий аушская наб., д. 4/ Филиал ППП "Патент", г, Ужгород, ул. Проек 4 на тимусзависимые антигены, Опыты проведены на 250 мышах-самцах, линии СВА, весом 18-20 г, которые были разделены на 5 групп. Мышам вводи" ли тимусзависимый антиген эритроци ты барана) в дозе 110 клеток вмли через сутки 3 раза ежедневно подкожно вводили вещество иэ селезенки по О, мг на мышь, а также вещества аналогов и прототипа. Затем 10 через 7 дней мышей забивали, брали кровь и определяли общепринятым мето дом титр антител и количество антителообразующих клеток. в селезенке,11Результаты опыта представлены втаблице,р дложенному способу 0 По авт. св, В 839090 50 По авт. св, У 111934 50 Яо патенту ФРГ В Р 5 2157077 50 Из таблицы следует,что испольэова ние вещества из селезенки позволяет значительно (статистически достоверно) увеличить количество антителообразующих клеток и образование и выход антител.Эти результаты могут быть использованы для повышения выхода антител 1у животных - продуцентов антител при получении лечебных антисывороток, что даст большой экономический эффект. Это вещество также можно будет использовать и для введения больным с целью стимуляции образования антител при введении различных вакцин, к которым антитела образуются в недостаточном количестве.