Способ определения перекиси водорода в биологических объектах

5-30 мин) измеряют оптическую плотность растворов при 625 нм на спектрофотометре или при 670 нм на фотоэлектроколориметре КФКМП против5 контроля, содержащего вместо перекиси водорода воду. Содержание НО в исходной пробе определяют по калибровочному графику по следующей формуле мМ; 10П 1 с иС =где и - разведение исходной пробыперед введением в инкубируему смесь,15Ч - объем вносимой пробы, мл 3В - оптическая плотность раствора против контрольного, несодержащего Н О,к - коэффициент для НО, находимый из калибровочного опыта(обычно в описанных условиях для фотоэлектроколориметра КФКМП он равен 0,35).П р и м е р 1. Исходную пробу,25.;одержащую НОа, развели в 100 раз.Для анализа взяли 0,1 мл. Оптическаяплотность фотометрируемого растворасоставила 0,210 (ФЭК КФКМП, 670 нм,1 см). Калибровочный коэффициент (т.е, Околичество микромолей Н О в 4 мл пробы, соответствующей оптйческой плотности 1).для данных условий равен0,35.Следовательно, исходная концентрация Н О равна С = 73,5 мМ.П р и м е р 2, Анализ перекисиводорода, генерируемой в оксидазной реакции (метод определения активности оксидаз), 40А. Определение активности алкогольоксидазы, К анализируемой пробе (5- 100 мкг белка) прибавляют 400 мкл 0,5 М фосфатного буфера, 4 рН 7,0-7,5, 400 мкл 2 мМ гваякола, 400 мкл 2 мМ45 сульфата и-аминодиэтиланилина (или дихлоргидрата и-аминодиметиланилина), 400 мкл 100 мМ метанола, объем пробы доводят до 3;8 мл водой. Реакцию на- чинают прибавлением 200 мкл 0,17-ной пероксндазы хрена ("Реанал" К 2 = 0,6) и через 30 с измеряют приращение оптической плотности за 1 мин при 670 нм фотоэлектрокалориметра КФКМП в режиме "Активность , Удельную актив 35 ность Фермента (генерируемой перекиси водорода за 1 мин на 1 мг белка) рассчитывают по формуле, мкмоль:ЬЭ/мин й иСогде Ь П/мин - приращен Возможно определение перекиси водорода в присутствии гемсодержащих пигментов, в частности гемоглобина крови. ие оптическойплотности за 1 мин;и - разведение растворафермента перед прибавлением реагентов;Ч - объем раствора фермента, вводимого в пробу,мл,С - исходная концентрация белка, мг/мл;- коэффициент для НОгнаходимый из калибровочных опытов,(в описанных условиях онравен 0,35).Исходную пробу бесклеточного экстракта метилотрофных дрожжей, содержащего алкогольоксидазу, развели в100 раз. Концентрация белка в исходном экстракте 5,5 мг/мл. Для анализа взяли 0,2 мл. Приращение оптической плотности за 1 мин составило0,125 (фЭК КФКМП, 670 нм; 1 см).Калибровочный коэффициент в данныхусловиях равен 0,35. Следовательно,удельная активность алкогольоксидазы в исходном экстракте равна А= 3,98 мкмоль/мин мг белка,Б. Определение активности глюкозооксидазы. Анализ и расчет проводятточно так же, как в примере 2 А стой лишь разницей, что вместо метанола испопьзуют 100 мМ глюкозы, а вкачестве буфера используют 0,5 Мцитрат-ИаОН, рН 6,0.Граничные значения концентрациихромогенов (концентрация Н О 50 мкМ)предлагаемого способа сведены втабл.1.Чувствительность предлагаемогоспособа повысилась в 2,5 раза.В табл.2 дано сравнение чувствительности определения перекиси водорода по предлагаемому методу (хромоген - смесь гваяколы и и-аминодиэтиланилина) и известному (хромогени-Фенилендиамин). Условия: 50 мМфосфатный буфер, рН ,О, концентрация хромогенов 0,25 мМ пероксидазы хрена (К 2 = 0,6) 0,05 мг/мл.Спектрофотометр СФ, 1 см.1636772 концент-0,5 мм, а 1 и и-аминодиэтиланилина при рации каждого компонента О,Т а б л и ц 5 Концентрация гваякоОптическаяплотность Приростоптической ла и п-аминоконтроля(без Нй) диэтиланили 10 на, мМ плотности,0НФз Как следует из табл.З, при анализе НО в пробах, содержащих кровь (гемолизат), с помощью известного способа резко повьппается оптическая плотность холостой пробы (контроля) - до 0 510 при разведении кроЭ15 ви в 100 раз, чторезко ухудщает удобство, точность и чувствительность анализа. В случае применения предлагаемой хромогенной системы (гваякол + + и-аминодиэтиланилин) оптическая 20 плотность контроля в присутствии крови в 7,5 раз ниже по сравнению с известной, что связано с неперекрывапием спектров поглощения продукта реакции и гемоглобина. 25 Таблица 2го,569 Контрол Бездобав ления гемо лизата 0,288 0,556 0,11 о,гг 0 0,034 5 . 0,268 0 0,437,510 ,57 ,641 0,182 0,06 О,3 Влияние гемолизата крови на определение перекиси водорода по предлагаемому методу (хромоген - смесь гваяколы и и-аминодиэтиланилина) и известному (хромоген - и-фенилендиамин) показано в табл.З. Условия аналогичны табл.2,1 Формула изобретения Способ определения перекиси водорода в биологических объектах путем добавления к исследуемой пробе буферного раствора, пероксидазы и хромогена, инкубации пробы до прекращения увеличения оптической плотности и спектрофотометрирования, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повьппения чувствительности способа при одновременной возможности осуществления способа в присутствии гемсодержащих пигментов, в качестве хромогена используют смесь гваякола 0,010,0250,050,10,250,3750,50,751,02,55 0,005 0,010 0,015 0,028 0,104 0,161 0,272 0,915 1,197 2,102 2,33 0,090 0,447 0,517 0,550 0,560 0,550 0,500 0,412 0,327 0,096 0,064