Способ сохранения иммунокомпетентных клеток

3(59 С 12 Я ТЕНИЯ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕ К АВТОРСКОМУ С 8 ИДЕТЕЛЬСТВУ Об ОСУДАРСТВЕКНЫЙ КОМИТЕТ СССР ГЮ ДЕЛАМ ИЭО 6 РЕТЕНИЙ И ОТКРЫТ(54)(57) СПОСОБ СОХРАНЕНИЯ ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТОК путем культиви" рования их в питательной среде, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения срока сохранения функциональной активности иммунокомпетентных клеток, в предвари". тельно охлажденную до 5-15 С питательную среду вводят 10-ный раст. вор желатина и культивирование проводят при постепенном понижении температуры с периодическим перемешиванием, а хранение осуществляют при температуре от 0 до 4 С.Известен также способ сохраненияиммунокомпетентных клеток путемкультивирования их в питательнойсреде ИсСоу 5 а с глутамином и антибиотиками 1,2,Однако такой способ ведет к нарушению функциональных характеристик иммунокомпетентных клеток, кро"ме того, срок сохранения их ограничен (до 3 сут.).Целью изобретения является повышение срока сохранения функциональ"ной активности иммунокомпетентныхклеток.25Указанная цель достигается тем,что согласно способу сохранения иммунокомпетентных клеток путем культивирования их в питательной среде,в предварительно охлажденную до5-15 С питательную среду вводятто-алый раствор желатина и культивирование проводят при постепенномпонижении температуры с периодическимперемешиванием, а хранение осуществляют при 0-4 С.Способ осуществляют следующимобразом.Гепаринизированную периферическуюкровь (25 Е(1 мл гепарина Спо Офа), разведенную в среде 199 всоотношении 1:3, или гомогенат тканей органов, например селезенкиили трансплантированной почки, на"слаивают на стандартный градиент 45плотности Фиколл-верографина(1,077-1,078).Выделение иммунокомпетентных клеток производят при400 д 30 мнн. Выделенные иммуноком"петентные клетки трижды отмываютот Фиколла и верографина средой199 при следующем режиме центрифугирования: 100 д на протяжении10-15 мин, Затем полученные лимфоциты помещают в стеклянные емкостис предварительно охлажденной до 555-150 С питательной средой 199, до"полнительно содержащей желербразую-,щие компоненты (фабричный 10-ныйраствор желатины, Фиксирующие при понижении температуры (до 0-4 "С) иммунокомпетентные клеткиво взвешенно-разделенном состоянии и поддерживающие их в жизнеспособном состоянии, а также инактивированную сы"воротку 1 группы крови человека, 5 ЗО Изобретение относится к медицине, в частности к способам консервации иммунокомпетентных клеток.Известен способ сохранения культуры лимфоцитов, заключающийся в том, что лимфоциты периферической 5 крови замораживают и хранят при (-170)0 С в течение 3-6 нед. Г 11.Однако известный способ требует дсрогостоящей аппаратуры с программным замораживанием и оттаива нием.1-ный раствор 1-глутамина и 2-ныйраствор 1-аспарагина при следующемсоотношении компонентов, мас.гг 0,05-0,5 Среда 199 , 0,01-0,8Инактивированнаясыворотка 1 группы крови человека10-ный растворжелатина 0,1"1,010-кратная среда 199 0,01-0,11-ный раствор1-глутамина 0,001-0,0082"ный раствор1-аспарагина 0,001-0,008При этом сохранение иммуноком" петентных клеток в культуральной среде производят при 0-4 С.Концентрация клеток доводится до 1-2 10 клеток на 1 мл питательной среды.Емкости с культуральной средой и клетками ставят в бытовой холо" дильник и время от времени периодически встряхивают до момента перехода культуральной среды из жидкого состояния в желеобразное с последую" щим визуальным контролем равномерного распределения клетокЕсли помещенные в емкости кЛетки за время застывания культуральной среды и перехода ее в состояние геля успевают преимущественно соб" раться у дна емкостей, необходимо разогреть содержимое емкостей при температуре, не превышающей 37 фС, а затем снова охладить до 0-4 фС.Образовавшийся гель с иммунокомпетентными клетками культивируют при 0-,4 С.При этом иммунокомпетентные клетки получают из одного забора крови и/или органов.П р и м е р, Предлагаемый способ сохранения иммунокомпетентных клеток испытан на культурах клеток крови больных, проходящих курс гемодалиэного лечения по поводу терминальной почечной недостаточности, а также на культурах крови больных раком мочевого пузыря П ст., клиническая группа 11 о, и культурах клеток крови практически здоровых лиц. Кроме того, тестировались иммунокомпетентные клетки, выделенные иэ селезенок практически здоровых крыс и из селезенок доноров трупной почки.Выход клеток после выделения составил во всех случаях 75-90, Проба на жизнеспособность клеток после выделения из периферической гепаринизированной крови выявила высокий выход жизнеспособных клеток.После сохранения иммунокомпетентных клеток по предлагаемому способу на протяжении различных1073281 сроков (1-.6 дн проба также выявила высокий выход;жизнеспособных клеток (табл.1.Количественные характеристики ,нммунокомпетентных клеток (Т-и В-лимщ фоцитов) определялисв в реакции 5 розеткообразования .с эритроцитами баранаг Е- и ЕАС"РОК (табл,2).функциональные параметры Т- и В"лимфоцитов изучались в реакциях бласттрансформации лимфоцитов 30(РВТЛ) под влиянием митогенныхдоз ФГА ("МеИсоае, Еп.ф) и ЛИС(выделенный из Е.сой штаьик 0,5).Учет реакций производился морфологинескю(.способом. Количество сохранившихся иммунокомпетентных клеток, Ф, на протяжении, дн. Срежевыделенныев стандартном градиенте фиколлверографина лимфоциты, В 83 75-90 85 90 90 80щщщщщщщщщщщщщщщщщщщщщщщщВ табл.2 приведены количествен- яммунокомпетентных клеток в процессе ные и качественные характеристики хранения.3 Таблица 2 Эритроциты Свежевыделенные клетки, ЪКоличество иммунокомпетентныхклеток, Ф при хранении, сут Группа практически здоровых лнц (и 15) 48,2 ф 15, 7 46,3+9,7 Е-РОК 40,513,8 20,51,4 14 814 0 20,1 фб, 352,4+17,053 ф 2 0 57,3+З,б 25,5+2,75 21,2+4,1 22,514,5 Группа больных, получающих курс гемодиализноголечения по поводу терминальной почечнойнедостаточности (п=13) 41,3115,5 38,5+5,8 ЕщРОК 34,5+5,2 815,027,517,5 Е АСщРОК 12.,5+5,0 РБТЛ на ФГА РБТЛ на ЛПС 32 у 514 еЗ 11,318,4 1 б,3+92 Е АСщРОКРБТЛ на ФГАРБТЛ на ЛГК 14,2+7,1 31,4111,2 18,1 ф 79 В табл.1 представлены данные выхода иммунокомпонентных клеток, выделенных в стандартном градиенте плотности фиколл-верографина при различных сроках их хранения.ГТаблица 1.,1073281 Продолжение табл, 2 Свежевыделенные клетки,Количество иммунокомпетентныхклеток, % при хранении, сут Эритроциты Группа больных раком мочевого пузыря П ст.Па клиническая группа (и= 11) 19,3+6,3 20,2+5,8 17,5 ф 8,1 Е РОК ЕАС-.РОК 13,3+5,2 12,416,1 13,7+8,3 19,3+7,1 9, 315,7 7+4,0 10,8+4,1 РБТЛ на ФГА 14,3+3,5 1917,4 РБТЛ на ЛПС Составитель Т.Крюкова Редактор Н,Швыдкая Техред О.Неце Корректор А.ИльинЗаказ 272/23 Тираж 522 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж"35, Раушская наб., д. 4/5Филиал ППП Патентф, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Таким образом, способ позволяет, ности клеток в 2 раза при сохранении,повысить срок хранения жизнеспособ высокой Функциональной активности.1