Способ индукции супрессорных клеток в периферической крови людей

СоОэ СОВЕТСНИХщюлаеепиРЕСПУБЛИК 5 Е О 1) 3 5 ОЗ)5 О ИСАНИЕ ТЕН су ктевой ся к медицинеии, и можетоценки.иммунн бретение относит аби доров аю иц с па и с г е и рики зи дой 19 вляется ускоресупрессорной кже упрощение торожрогр077) аю центри400 д.лачко" т рови получаю те плотности бр аб атывают А 2387 в концечение 5-20 ают и опред ь,аеас носят с пом ки дв 200 надос еляют сле удаления ируют в среУ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(54) СПОСОБ ИНДУКЦИИ СУПРЕССОРНЫХ КЛЕТОК В ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЛЮДЕЙ(57) Изобретение относится к медицине,а именно к иммунологии, я может бытьиспользовано для оценки имунного статуса. Цель изобретения - повышениепрессорной активности клеток, ускорев частности к иммунолобыть использовано длястатуса человека в нотологией иммунной сисЦелью изобретенияние индукции, повышеняактивности клеток, аспособа,Способ осуществляют Следуюразом.Иэ периферической кмононуклеары в градиенфиколла-верографина, окальциевым ионофоромтрации 5-10 мкмоль в тотмывают клетки, обл чсупрессорную активност нне и упрощение способа. У обследуеьых берут кровь, выделяют лимфоциты, ресуспенцируют их, инкубируют с ионофором А 23 87, взятым в концентрации 5- 1 О мкмоль, в течение 5-20 мин. Клетки отмывают, облучают и совместно инкубируют с необработанными лимфоцитами и ФГА, Затем по включению Н-тимицинаэопрецепяют супрессорную активность. Супрессорный эффект клеток при действии ионовора А 23187 выше на 18,3- 46,3 Ж по сравнению с прототипом, В результате использования предлагаемого способа сокращается время анализа на 48 ч, упрощается постановка способа в сравнении с прототипом,и м ер. Кровьяз л х доноров в объеме стерильные лаборато епарином (15 ец/мл к рованную кровь смеши 9 в соотношении 1:3 но на градиент плот афин (плотность сме Центрифужкае проб терильной резиновой фугируют в течение 3 Собранную интерфазу), содержащую монон н чистые центрифуж щью пастеровских пи ажды отмывают в среде в течение 1 О мин, По дка клетки ресуспензрные пробирт рови) . Гепавают со сре и наслаивают ности фиколл. си 1,076 ирки э акры- пробкой и 0 мин при ( белое обуклеары,переные пробирки летокКлетсФормула изобретения Составитель В,ЛитовченкоТехредЛ.Сердюкова Корректор И,Муска Редактор Е,Копча Заказ 1915 Тираж 512 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г,ужгород, ул. Гагарина,101 3 15786 де 199 в концентрации 10 ф/мл и и объеме 5 мп помещают в центрифужные пробирки, В пробирки вносят кальциевый ионофор А 23187 (Явша) в концентрации 1 О мкмоль. Предварительно его растворяют в 70 этаноле до концентрации01 мг/мп и хранят при - 20 С. Рабочие разведения А 23187 готовят на среде 199, Концентрация этанола в рабочих 10 разведениях А 23187 составляет 0,05%, Пробирки с обработанными ионофором клетками инкубируют 10 мин при 37 С при периодическом встряхиваниипосте чего трижды отмывают в избытке хо лодной среды 199 центрифугированием в течение 10 мин при 200 ц, Осацок после последнего центрифугирования ресуспензируют н среде культивирования (СК) следующего состава: среда ЯРМ 1-1640, 20 1 0% инак тивиров анной наг рев анием феталь-. ной сыворотки, 2 мМ глутамина,4 мМ НЕРЕЯ-буфера, 20 мкг/мл гентамицина, Концентрацию клеток доводят до 10 /мл СК, их помещают в пенициллино6вые флаконы и облучают в дозе 2000 рад на установке, /Стебель За" ( СЯ, мощность дозы 9,7 Гр/мин), Контролем служат клетки; подвергшиеся тем же самым воздействием, з а исключением о бр абот ки ионофором, Вместо ионофора в пробирки добавляют среду 199, содержащую 0,05% этанола, После облучения клетки вносят в плоскоцонные 96-луночные микроплажпеты в каждую лунку по 100 мкл (10 клеток), В те же лунки вносят35 равное количество мононуклеарон в том же объеме.СК, выделенных от аутологичных или аллогенных доноров, а также 10 мкг/мп ФГА в объеме 50 мкл. Каждую 40 пробу ставят в трек параллелях, Культивирование прОводят в СО-инкубаторе во влажнбй среде, содержащей 5% СОд, при 37 С. в течение 72 ч. За 6 ч до. окончмя 1 я культивирования в каждую 45 лунку вносят 1 мк Ки Н - тимидина вобъеме 10. мкл. Клетки осаждают нафильтрах с помощью полуатоматического харвестера. Высушенные фильтры помещают в стеклянные флаконы, содержащие сцинтилляционную жидкость, приготовленную на основе толуола. Активность образцов определяют в счетчике"МагП",Обработка в течение 10 минмононуклеаров кальциевым ионофором А 23187приводит к индукции клеток, способных резко подавлять РБТ на ФГА: ЛС колебался от 70,8 до 93,8%, в среднем82,1% при исследовании аутологичнойРБТ и от 42,4 до 95,7%, в среднем74,1% при исслецовании аллогенныхРБТ,Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет значительно ускорить процесс, на 48 ч повыситьсупрессорную активность клеток - по. прототипу супрессорный эффект составляет в аутологической системе 63,9%, а попредлагаемому - 82,1% в аллогенной системе, соответственно 27,8% и 74, 1%, т. е. всреднем ниже на 18,3.-46,3%, а также упростить процесс за счетиспольэованияионофора А 23187. Способ индукции супрессорных клеток в периферической крови людей,включающий забор крови, выделение лимФоцитов, инкубацию н присутствии активатора, отмывку, облучениеи определение супрессорной активности, о т -л и ч а ю ш и й с я тем, что, с цельюповышения супрессорной активности клеток, ускорения и упрощения способа,в качестве активатора используют ионофор А 23187 в дозе . 5-10 мкмоль и инкубируют с ним лимфоциты в течение 520 мин,