Способ получения целлюлозолитических ферментов

,.80 0 ОПИСА ИЗОБРЕ ТЕЛЬСТВУ К АВТОРСКОМ по зкл. ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЬГГИЙ(56) 1. Михлин Э.Д. и Улезло И.В.Стимулятор роста и целлюлозолитической активности продукта целлюлозы-гриба Тг 1 сЬойегща ч 1 гЫе. Прикладная биохимия и микробиологияТ.5, вып.б, с,673-677.2. Авторское свидетельство СССРаявке Р 3307216/28"13,С,12 Н 9/42 (прототип).(54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЦЕЛЛЮЛОЗОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ путем глубинного культивирования продуцентаТг 1 сЬойеппа ч 1 гЫе 44 на питательной среде, содержащей свекловичный жом, однозамещенный фосфат ка.лия, сульфат магния, сульфат аммо-ния, сульфат хрома и воду, о т -л и ч а ю щ и й с я тем, что, сцелью повышения активности целлюлаз, в культуральную жидкость назкспоненциальной стадии роста дополнительно вводят сульфат хромав два приема: сначала на 24-32 чкультивирования в количестве 0,20,4 г/л и затем на 72-96 ч в количестве 0,3-0,5 г/л.активность целлюлазы составила8 ед.мл.Однако в данном способе не учитываются оптимальные концентрацииактиватора на разных стадиях культивирования; актинация роста и развития Тг 1 сйодегша ч 1 г 1 йе 44 осуществляется недостаточно; крометого низка Ферментативная актив-З 0ность.Наиболее близким к изобретениюпо технической сущности являютсясреда и способ получения целлюлоэолитических ферментов путем глубинного культивирования продуцентаТг 1 спойеппа ч 1 г 1 де 44 на среде, содержащей свекловичный жом, одноэа-мещенный фосфат калия, сернокислыймагний, сульФат аммония, сульфат хро ма и лизаты дрожжей 2.Культивирование ведут в течение144 ч, активность ферментов10,4-11,2 ед/мл,Недостатками известного способаявляются низкая активность Фермента и большая продолжительность культивирования.Целью изобретения является повышение активности целлюлаз.Поставленная цель достигаетсятем, что согласно способу полученияцеллюлоэолитических Ферментов путем глубинного культивирования продуцента - Тг 1 спойепва ч 1 гЫе 44 напитательной среде, содержащейсвекловичный жом, однозамещенныйфосфат калия, сульфат магния, сульфат аммония, сульфат хрома и воду,в культуральную жидкость на зкспоненциальной стадии роста дополнительно вводят сульфат хрома в днаприема; сначала на 24-32 ч. культивирования в количестве 0,2-0,4 г/ли затем на 72-96 ч,в количестве0,3-0,5 г/л. 65 50 Изобретение относится к Фермент ной подотрасли микробиологической промышленности и может быть использовано для получения целлюлазы методом глубинного культивирования микроскопических грибов на жидких питательных средах.Известен способ получения цел- . люлозолитических ферментов путем глубинного культивирования продуцента - Тг 1 сйойеппа ч 1 гЫе 44, заключающийся в применении н качестве стимулятора роста и целлюлозолитической активности продуцента целлюлаэы экстрактов из биомассы, образованных при термофильном мета- . новом брожении мелассо-зерновой, ацетонобутиловой барды, которые содержат вещества, обладающие способностью ускорять рост и увеличивать накопление мицелия и повышать С 20 и С гриба Тг 1 сйойегва ч 1 гЫе 1). Сущность способа заключается нследующем.Готовят питательную среду, содержащую, вес.ЪСвекловичный жом 1,5-,0Дрожжи кормовые 0,3-1,0ОднозамещенныйФосфорнокислыйкалий 0,2-0,4Аммоний сернокислый 0,2-0,5Магний сернокислый 0,02-0,05Сульфат хрома 0,02-0,04Вода ОстальноеПитательную среду. готовят путемпоследовательной загрузки всех компонентов при постоянном перемешивании,рН среды доводят ортофосфорнойкислотой до 4,б,вводят дополнительно.до стерилизации сульфат хрома в ко"личестве 0,2-0,3-0,4 г/л, стерилиэуют острым паром 1 ч при 0,8 ата.Охлажденную до 37 С питательнуюсреду эасеивают посевным материаломТг 1 сйойегва ч 1 гЫе 44 и культивируют глубинным способом при постоянной аэрации культуры воздухом израсчета 1 об/об среды, По истечении24-32 ч роста культуры н ферментервводят вторично сульфат хрома израсчета 0,2-0,3-0,4 г/л в виде стерильного раствора на стадии активного потребления питательных веществ;Третий раз сульфат хрома вводят настадии актинного синтеза целлюлазына 72-96 ч роста продуцента в количестве 0,3-0,4-0,5 г/л также в виде стерильного раствора.П р и м е р 1 (контроль). В Ферментер объемом 50 л при коэффициенте, заполнения 0,5 загружают питательную среду с оптимальными соотношениями компонентов, мас.Ъ: свекловичный жом 1,5.; дрожжи кормовые 0,3;.(БН) ЯО, 0,2, КНРО 0,2, МВО,0,02,Все компоненты питательной средыпоследовательно загружают в Ферментер при перемешивании (180 об/мин),аэрировании воздухом из расчета1 об/об среды, рН среды доводят ортоФосфорной кислотой до 4,6, и всюпитательную среду стерилизуют острымпаром 1 ч при 0,8 ата. Охлажденнуюдо 37 С питательную среду засенаютпосевным материалом Тг 1 сйойегща ч 1- гЫе 44. Глубинное культивированиеведут 144 ч. Максимальная Ферментативная активность составляет12 ед./мл (метод Сомоджи-Нельсона).П р и м е р 2. Подготовку питатель.ной среды производят аналогично примеру 1. Состав питательной средывводят дополнительно 0,2 г/л или5 кг сульфата хрома до стерилизации. Стерилизацию и засев посевным1073282 Составитель .Е.ВоробьеваРедактор Н,Швьщкая Техред И,Лсталош Корректор А.Ильин Заказ 272/23 Тираж 522 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Филиал ППП фПатентф, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 материалом проводят аналогично примеру 1.После 24 ч роста культуры вводят еще 0,2 г/л или 5 кг сульфата хрома в виде стерильного раствора. В третий раз сульфат хрома вводят 5 иа 72 ч роста.продуцента из расчета 0,3 г/л или 7,5 кг в виде стерильного раствора. Процесс глубинного культивирования ведут.до максимального синтеза Фермента, т.е. до 10 108 ч роста, Ферментативная активность целлюлаэы в этом случае составляет 14 ед./мл, (метод тот же),П р и м Е р 3. Подготовку пита ,тельной среды производят аналогично примеру 1. В состав питательной среды до стерилизации вводят суль.Фат хрома иэ расчета 0,3 г/л или 7,5 кг. Стерилизацию и засев пита тельной среды производят аналогично примеру 1. На 28 ч роста культуры Тг 1 сЬойегва ч 1 г 1 йе 44 вводят вторично 7,5 кг сульфата хрома в виде стерильного раствора, третий 25 раз сульфат хрома вводят. на 84 ч роста культуры из расчета 0,4 г/л или 10 кг в виде стерильного раствора. Глубинное культивирование заканчивают на 108 ч роста культуры. Ферментативная активность целлюлазы в этом случае равна 15 ед./мл (метод тот же) .П р и м е р 4. Подготовку пита" тельной среды производят аналогично примеру 1. В состав питательной среды до стерилизации дополнительно вводят 10 кг сульфата хрбма из расчета 0,4 г/л. Стерилизацию и засев питательной среды .производят ;аналогично примеру 1. На 32 ч роста продуцента вторично вносят 10 кг сульфата хрома иэ расчета 0,4 г/л в виде стерильного раствора. На 96 ч роста продуцента в третий раэ вносят сульфат хрома в количестве 12,5 кг иэ расчета 0,5 г/л в виде стерильного раствора. Глубинное культивирование продолжают до мак- . симального накопления Фермента с активностью 15,5 ед./мл на 118 ч роста продуцента.Таким образом, реализация изобретения позволяет повысить. активность целлюлаз.