Способ диагностики вирусного гепатита

.А 61 В 10/О АРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ ССС М ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКР. Н АВТОРС ьстВ УС 8(71) Ордена Ленина и ордена вого Красного Знамени научно довательский институт педиат АМН СССР(56) 1. Методические рекомен к обнаружению австралийского антигенас помощю реакции и тации в агаровом геле. Сборн ных работ Института вирусологки им. Д.И. Ивановского АМН СССР, М., 1972.2. Ворожбиева Т.Е., Будницкая П.З, Любашевская Е.Е., Ананьев В.А. Использование метода иммуноауторадко- графин для индикации австралийского БН-антигена. - Сборник трудов фАвстралийский (ЯН-НВ антиген при вирусном гепатите. М., 1973, 48-523. Глан П.В., Алексеева Л.П. Микрометод РБТ малых лимфоцитов и его применение в клинике. - В кн.: Иммунологкческке аспекты трансплантации. М., 1971, 57-62 (прототип),(54) (57) спосоБ диАГностики ВирусноГО ГЕПАТИТйпутем исследования сенси.билизированных лимфоцитов, о т л ич а ю ц к й с я тем, что, с целью Трудо-ускорения к снижения травматнчности -иссле- способа, кровь для исследования берии: рут иэ пальца, ставят реакцию торможения миграции лейкоцитов с фетальной сывороткой, помещают пробу в дации .капил,няры, центрифугируют и по изме- (ЯН-НВ) нению расстояниямиграции лейкоци-. рецици- тов по сравнению с контролем диагноик науа- сцируют вирусный гепатит.Изобретение относится к медицине, в частности к диагностике вирусного геггатита.Известен способ диагностики вирусного гепатита путем выявления вирусных антигенов в сыворотке кро-. 5 ви с помощью реакции преципитации в геле, который заключается в том, что в агаре, приготовленном на буферном растворе, делают лунки центральную и периферические. В централь-О ную лунку помещают специфическую антисыворотку к НВЯАд, а в периферические лунки вносят исследуемые сыворотки больных и стандартны 1 с антиген. после заполнения лунок плас тинки с гелем инкубируют во влажной камере при комнатной температуре в течение 7 дн. Результаты учитываются по мере появления линий преципитации в первые три дня, оДнако более слабые линии могут быть вы даны только по завершении семидневной инкубации Ц .Недостатками этого метода являются длительное время инкубации, а также обязательное наличие высоко- специфической тест-системы.Известен также иммуноауторадиографический метод диагностики вирусного гепатита, который заключается в выявлении невидимого преципитата, образованного 5 Н-антигеном и кроличьими антителами с помощью меченой (51 или б ",1 радиоактивной анти- сыворотки к кроличьему-глобулину. Основные этапы иммунорадиографии 35 (ИР) состоят в следующем. На предметное стекло наливают агар Дифко на буфере Рг 1 псе, В остывшем агаре делают центральные и периферические лунки. В центральные лунки вносят 40 сыворотку, содержащую антитела к 5 Н - антигену а в периферические лунки закапывают сыворотки больных.и различные разведения 5 Н-антигена из тест-системы. Затем стекла инкубируют 45 во влажной камере 48-72 ч и отмывают в течение суток. После отмывания агаровые пластинки, снятые со стекол, погружают на 1 ч в радиоактивные. антитела и оставляют на ночь во влажной камере, После отмывания в течение суток пластинки вновь переносят на стекла, Фиксируют и высушивают, На высушенный агар накладывают Флуорографическую пленку, заворачивают в темную бумагу и хранят в темной комнате 1 - 7 сут, Невидимый радиоактивный преципитат дает изображение на пленке 21; Недостатками этого способа явля ются чрезвычайно долгая продолжительность реакции 10 - 14 сут, ее многоэтапность, а также необходимость применения специального оборудования и помещения для работы и 65 хранения радиоактивных меченных сывороток.Наиболее близким к изобретениюявляется способ диагностики вирусного гепатита путем выявления сенсибилиэированных лимфоцитов с помощью реакции бласттрансформациилимфоцитов периферической крови (31,Недостатками известного методаявляются большое количество крови(8 мл), необходимое для реакции изабираемое из вены, большая продолжительность (4 сут) и многоэтапностьметодики необходимость использования дефицитных реактивов, а такжепроведение работы только высококвалифицированным врачом-лаборантом.Целью изобретения является ускорение и снижение травматичности способа.Поставленная цель достигается .тем, что согласно способу диагностики вирусного гепатита путем исследования сенсибилиэированных лимфоцитов, кровь для исследсеания берутиз пальца, ставят реакцию торможения.миграции лейкоцитов с фетальнойсывороткой, помещают пробу в капилляры,.центрифугируют и по изменениюрасСтояния миграции лейкоцитов, посравнению с контролем диагносцируютвирусный гепатит,Способ осуществляют следующимобразом.У пациента берут кровь иэ пальца,ставят реакцию торможения миграциилейкоцитов с фетальной сывороткойна двух предметных стеклах, опытноми контрольном. В контрольную пробувносят 0,04 мл среды 199, в опытнуюпробу вносят 0,02 мл среды 199 и0,02 мм поверхностного антигена гепатита В (НВА) с конечным титром1:4. Смесь и контрольной и.опытнойпроб набирают раздельно в пятиканальные капилляры, нижний конец .капилляра заливают цементом Фосфат ицентрифугируют 5 мин при 1000 об/мин.Затем запаивают открытые концы капилляров и инкубируют в течение 1824 ч при 18 - 22 фС. Расстояние миграции определяют под микроскопом, учитывая пять значений по числу каналовкапилляра. Вычисляют индекс миграциипутем деления средней величины миграции в опыте на среднюю величинумиграции в контроле. По величине индекса миграции диагностируют вирусный гепатит,Проведено исследование на 30 больных. Установлено, что индекс миграции соответствующий вирусному гепатиту равен 0,8-. 0,2.Способ поясняется следующими примерами.П р н и е р. Больной,Б-н Евгений,8 лет, принят в состоянии средней тяжести на пятый день болезни, нашестой день, болезни была взята кровьна реакцию торможения миграции лейкоцитов с митогеном НВ 5 А. Для .этогоиз пальца берут 0,2 мл крови в силнконированную пробирку с гепарином.Гепарин добавляют в пробирку из расчета 2 ед. на 0,1 мл.крови. Из взя.той крови отбирают по 0,06 мл на каждое из двух предметных стекол: опытное и контрольное. В обе пробы добавляют по 0,015 мл фетальной телячьей сыворотки. В контрольную пробувносят также 0,04 мл среды 199. Вопытную пробу вносят 0,02 мп среды199 и 0,02 мл поверхноСтного антигена гепатита В(НВ 5 А) с конечным . 15титром 1:4Смесь из контрольной иопытной проб набирают раздельно впятиканальные капилляры с плоскопараллельными стенками длиной 4,5 см,.оставляя незаполненным на 0,5 смверхний конец копилляра. Нижний конец .капилляра запа(вают цементом,фосфатф. Для затвердения цементафосфатфф капилляры оставляют ввозвышенном положении под углом 100открйтым концом кверху на 15 мин;Затем капилляры завертывают в марлю(отдельно контрольный и опытный) ицентрифугируют 5.мин при 1000 об/мин.После центрифугирования открытыйконец капилляра также закрывают цементом ффосфат Капилляры помещают в чашку Петри бывшим открытымконцом вверх под углом 10 о, накрывают крышкой, выдерживают при 2022 аС от 18 - 24 ч. Учитывают мигра- "35цию лейкоцитов в опытной и контрольной пробах с помощью микроскопа,используя окуляр,х 7,5 с делениямии объектив х 8, Среднюю величинумиграции вычисляют,из пяти значений 40соответственно числу каналов капилляра. У данного больного значениямиграции иэ канала опытного капилляра следующие: 1,0; 1,0; 0:5; 0,5;0,5 делений окуляра, среднее значение их равно 0,7. Значения миграциииз каналов контрольного капилляраследующие 2,0; 2,01 2,0; 1,5; 1,5со средним значением 1,8 делений окуляра, Следовательно индекс миграции(ИМ) равен 2" = 0,38 ед. Учитывая,1,Ьчто показатели ИМ 0,8 - 0,2 ед свидетельствуют о торможении миграциилейкоцитов, наличие у данного больного ИМ, равного 0,38 ед, означаетрезкое торможение миграции лейкоцитов под влиянием НВЗАб, свидетелЬствующее о наличии у больного вирусного гепатита. В связи с симптомами выраженной 60 интоксикации, сохранявшимися в течение двух недель больному проводи.лась дезинтоксикационная терапия, в том числе вливания гемодеза, 10 Ъ- ной глюкозы, препараты АТФ, кокар- , 65 боксилаэа, усиленная спаэмолитическая и желчегонная терапия.Обратная динамика болезни отмечалась на 24 день болезни, Значительно улучшилось самочувствие, начала уменьшаться желтуха, исчез- ли петехиальные элементы. Домой выписан в .удовлетворительном состоянии на 42 день болезни по настоянию родителей, При выписке сохранялась легкая иктеричность кожи и склер,печень пальпировалась на 1,5 см, ниже реберной дуги. В биохимическом анализе крови билирубин общий 3 мг Ъ, билирубин свободный 2,25 мг Ъ, билирубйн связанный 0,75 мг Ъ, активность фруктозомонофосфат-альдолазы снизилаеь до 4 .ед., а.аланинаминотрансферазы до 18 ед.Таким образом, у ребенка с типичной клиникой вирусного. гепатита В, протекавшего в среднетяжелой форме, не бйл обнаружен. в крови НВБАд, однако на седьмой .день болезни была выявлена специфическая сенсибилизация к НВбА, что позволило точно диагностировать вирусный гепатит в. ранние .сроки заболевания, обеспечить госпитализацию в палатУ по профилю (гепатит В) и назначить более энергичную дезинтоксикационную терапию.П р и м е р 2, Больной К-в Станислав, 4 лет. В клинику поступил на шестой день болезни и второй день желтухи, в состоянии средней тяжести. Иктеричность была отчетливо выражена, печень чувствительная,при па 1 ь-. пации, выступала на 2 смиз подреберья. В биохимическом анализе крови на седьмой день болезни: билирубин общий 3,24 мг Ъ, билирубин свободный 1,37 мг Ъ, билирубин связанный 1,87 мг Ъ, активность фруктоэомонофосфат-альдолаэы была 10 ед., аланинаминотрансферазы 32 ед., тимоловая проба 30 ед. При повторных определениях доступными методами НВбАу в крови не найден. На седьмой день болезни была проведена реакция торможения миграции лейкоцитов с НИА в качестве антигена, Миграция в каналах контрольного капиЛляра составила 5 О; 5 О; 5 О 4 5; 4 0 со средним значением 4,7 делений окуляра, Миграция в опыте равнялась 1,0; 1,0; 1,0 р 1,0 р 1,0 р 1,0 со средней величиной миграции 1,0 делений окуляра, Следовательно, ИМ оказался равнымо - 0,21 ед. Этот показатель4 ЛИМ свидетельствовал о высокой степени сенсибилизации организма больного к поверхностному антигену (НВбА) гепатита В, Таким образом, у ребенка при отсутствии в крови (раннее исчезновение) НВ 5 А была выявлена сенсибилизация к данному антигену, что позволило уточнить вид гепатита1061799 Составитель Н. ХрусталеваРедакторО, Черниченко Техред Л.Микеш Корректор А. Повх Заказ 10093/5 Тираж 713 Подписное 4 ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретениЯ и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 и поставить окончательный диагноз:вирусный гепатит В Ребенок был госпитализирован в палату по профилюгепатит В), Ребенок был выписан домой в удовлетворительном состояниина 29 день заболевания,. При выписке 5сохранялась субиктеричность склер,печень оставалась еще уплотненной ивыступала из подреберья на 0,5 см. Положительный зффект предлагаемо го способа диагностики вирусного гепатита заключается в ускоренйи диагностики вирусного гепатита, в возможности проведения дифференциальной диагностики вирусного гепатитаВ и гепатита А и, следовательно, вуменьшении риска перекрестного инфирирования вследствие ранней закладки больных в палаты по профилю (гепатит А и гепатит В) на основе ранней диагностики и дифференциальнойдиагностики двух видов вирусногогепатита, в связи с чем более раннемназначении адекватной терапии, в осуществлении этиологической диагностики хронического гепатита в доступности и простоте методики.