Способ иммобилизации микросом печени

(19) (11) ы) С 12 И 11/18; С 12,К ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ. и др. Иммобип цин печени беды УССР; Сер. Б, 59.113013,рчаков А, И.биохимии. М ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ ССПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТ(56) 1. Богатский А.Взация микросом ной фраккрыс на сипохроме, АН1979, .М 8, с, 656-62. Патент ГДР М)кп. С 07 9 7/02, 1973. Карузина М,ИАСовременные методы вна", 1977, с. 49-62.(54)(57) 1, СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЦИИМИКРОСОМ ПЕЧЕНИ путем ковапентногосвязывания их с матрицей, о т п и ч аю щ и й с я тем, что, с цепью цовышеиия монооксигеназиой активности истабипьности ююмобипизованных микросом,в качестве матрицы используют попиетипен с 6-10% привитой цопиакриповойкиспоты и процесс ведут в присутствиикарбодиимида при соотнсипении карбоцаимид - попиэтипен с привитой попиакрипо;вой кислотой 1: 5- 1: 1 2.2. Способ по п. 1, о т п и ча ю -щ и й с я тем, что процесс ведут прирН 7,2-7,6.и ей15 20 25 35 40 45 50 55 1 1Изобретение относится к биотехнопогии вчастности к;способам попучения иммобипизованных микросом печени, животныхи может найти црнменение в медицине биохимии (иммобипизованные таким образом микрооомы могут спужить удобной модецью апя изучения метабопизма лекарственных препаратов), в анапитической промышпенности (для созаания ферментных эпектроцов) и тонком органическом синтезе (дпя попучения органических веществ, таких как гидроксипированные стероицы, жирные киспоты, 1,4-бензаиаэепин-оны ) .В этих, цепях цепесообразно испопьэовать не топько отаепьные ферменты, нои фракцию микросом печени животных, так как это дает возможность устранить сложные дорогостоящие процессы выаепения и очистки исходных ферментов и проводить спожные ферментативные реакции одностадийно.Известен способ иммобицизации микросом печени на неорганической матрице(сипохроме) с помощью бифункционапьного сшивающего реагента (хпористого цианура и 2,4-топуипендиизоцианата) 1 .Однако попучаемый этим способом продукт обпацает пишь эстеразной активностью и не проявпязт монооксигенаэной активности.Наибопее бпизок к предлагаемому способ иммобипизации микросом печени, заключающийся в ковапентном связывании их с матрицей ( В Сй 1 активированной сефарозой. При этом процесс ведут при рН 7,4-7,7, а при иммобипиэации монооксигеназная система раэдепяется на компоненты: цнтохром Р, НАДФН- зависимую реауктазу н фосфатицнпхопин, а затем компоненты в любой поспедоватепьности ипи одновременно фиксируют на матрице (при этом один ипи два комионента могут оставаться в растворе в растворимом состоянии) Я .Необходимость раэаепения монооксигенаэной системы микросом печени на к компоненты (цитохром Р, НАДФН- зависимую редуктазу и фосфатиаипхопин) цереа иммобиаиэацией апя попучения стабипьного продукта, обпааающего актив - ностью, так как при иммобипизации самой системы микросом набпюдается попное отсутствие монооксигеназной активности, значитепьно успожняет процесс, требуя обработки упьтразвуком, хопатом и дезоксихонатом натрия и применения метода копоночной хроматографии. Монооксигенаэная активность иммобилиэованных указанным способом реконструированных систем ниэкаг при иммобипизации цитохрома Р(растворимая НАДФН- зависимая реауктаэа и фосфатиципхопин) она составпяет всего 30% от исходной, а при иммобипизации НАДФН - зависимой редуктазы (растворимые цитохром Ри фосфатидипхопин) сохраняется 26-40% монооксигеназной активности (опреаепена по реакции 8 -деметипирования), Стабипьность попученной таким образом монооксигенаэной системы невысока, так какчерез 72 ч остается всего 7% исходнойактивности. Таким образом, известныйспособ не обеспечивает достаточно высокой монооксигенаэной активности и стабипьности иммобипиэованных микросом,Цель изобретения - повышение монооксигеназной активности и стабипьностниммобипнзованных микросом,Указанная цепь достигается сог пасно способу иммобипизации микросом печени путем ковапентного связывания их с с матрицей, в качестве матрицы испопьзуют попиэтилен с 6-10% привитой попнакрнповой киспоты и процесс ведут в присутствин карбодиимнда при соотношении карбодиимиа - попиэтипен с привитой полиакриповой киспотой 1: 5-1: 12,Процесс осуществпяют при рН 7,2-7,6,Предпагаемый способ поэвопяет попучать нерастворимые микросомы, отпичающнеся высокой монооксигенаэной активностью и стабипьностью.Функцнонапьиые группы пегко моднфи цируются иэ-за рыхлой упаковки привито го функционального покрова(попиакрнловой киспоты ), функционапьные группы которого доступны апя взаимодействия ссшивающими реагентами по всей гпубинепривитого слоя, а специфический эффектповышения монооксигенаэной активностииммобипизованных микросом, вероятно,связан с созданием особых мягких условий иммобилизации в тонком при поверхностном спое, доступном для субстрата, привитой попиакриповой кислотой, т.е. аанные полимерные носитепи сочетают в себе преимущества линейных гомопопимеров н трехмерных попипнга вдов.Применение попиэтиленов с копнчеством попиакриповой киспоты меныним 6% нецепесообразно, таккак резко (ао 50% от от максимальной) уменьшается монооксигенаэная активность иммобипиэованных микросом, Увеличение копичества при витой попиакрнповой киспоты бопее 10% не поэвопяет создать однородного (по копичеству функционапьных групп) носи10 тепя, Поэтому используют попиэтипен с6-10% привитой попиакриповой киспоты,В процессе испопьзуют 0,1 М К -фон"1фатный буфер с 0,1 М КА; 1 мМЭДТА и 1 мМ дитиотреитопа на 20%ном гпицерине по объему в интервалерН 7,2-7,6, так как при значениям рН(табп. 1) сохранение монооксигеназнойавтивности иммобипизова нных микросоммаксимапьно.Весовое соотношение растворимыйкарбодиимид - попиэтипен с привитой:попиакриловой кислотой можно вариировать от .1:5 до 1:12, аапьнейшее егоУизменение уменьшает монооксигенаэн ю 15активность иммобипизованных микросом(табп, 2).Иммобипизация проводится при 5 еСв течение 24 ч.Попученные препаратыиммобипизованных микросом обпааают 20 значительной активностью по анипину,аиметипанипину, амидопирину и этипморфину, так как сохранение активностипо анипину составипо 25% (этот виа ивсе поспедунлцие в прототипе попностью 25 отсутствовапи), а при опредепении активности иммобипиэованных микросом печенипо аиметипанилину, амидопирину и этипморфину набпюдапось значитепьное увеличение активности (по сравнению с исходной): 116; 197; 8; 160% соответственно, Иммобипизованные преапагаемым спо. собом микросомы печени оказались ста бипьными при хранении при 5 С в течение0 4 недель.Микросомы выделяют иэ печени бепых крыс и кропиков согпасно известной ме- .тодике 3, активность по анипину, диметиланипину, амидопирину, этищюорфинутакже опредепяпи по 3 Быхоц микросомапьного бепка 21,7 мг/г печени; содержание цитохрома Р2,75 нмопь/мг бепка, активность по анипину 3,9 нмопь субстрата/нмопь цитохрома Рв мин при 37 С, активность по диметипанипину 45о49,7 нмопь субстрата-нмопь цитохромаРв мин при 370 С, активность по амидопирину 1 3,9 нмопь субстрата/нмопь цитохрома Рв мин при 37 С, акО тивность по этипморфину 5,5 нмопь субстрата-нмопь цитохрома Рпри 37 С 50 в мин.П р и м е р 1, 10 г попиэтипена с привитой попиакриповой киспотой (6-10%) суспендируют в 50 мп 0,1 М К-фосфатного буфера (с 0,1 М МС 1; 1 мМ ЗДТА и 1 мМ аитиотреитопа на 20% гпицерине по объему, рН 7,2) растворимого карбоци имида (1,0 г), затем аобавпяют суспенэию микросом (1 г бепка), доводят объем до 100 мп вышеуказанным буфером и встряхивают реакционную смесь 24 ч при 5 С.Препарат отфипьтровывают, затем цромывают спедующими буферными раствора 1. 2 и 0,1 М К-фосфатного буфера с 0,5 М КС 1, "1 мМ ЭДТА и 1 мМ аитиотреитопа на 20% гпицерине по объему, рН 7,2.22 и 0,1 М К-фосфатного буфера с 1 мМ дитиотреитопа на 20% гцицерине и хранят при 5 оСАктивность по анипину 0,967 нмопь субстрата/нмопь цитохрома Рв мин при 37 С (сохранение активности 25%),оАктивность по диметипанипину,4 нмопь субстрата/нмопь цитохрома Рв мин при 37 ОС (сохранение активности 116%), Активность по амицопирину 27,6 нмопь субстрата/нмопь цито- хрома Рв мин при 370 С (сохранение активности 197,8%). Активность по этипморфину 8,8 нмоль субстрата/нмопь цитохрома Рв мин при 37 С (сохранение активности 160%).После 4 недепь хранения при 5 С иммобипизова нных микросом активность по анипину составпяет 100%, а по диметипанипину 74% (от опрецепенной сразу поспе иммобилизации).Таким же образом проводят иммобилизацию фракции микросом на пониэтилене с привитой попиакриповой киспотой (6-10%) с тем же буфером, топько при рН 7,4 и 7,6.Попучают анапогичные резупьтаты,П р и м е р 2. 10 г попиэтипена спривитой попиакриповой киспотой (6-10%)суспенаируют в 50 мп 0,1 М К-фосфатного буфера (0,1 М КС 1, 1 мМ ЭДТА и1 мМ аитиотреитопа на 20% гпицерине пообъему, рН 7,2) растворимого карбодиимида (0,8 г), затем добавпяют суспенэию микросом (1 г белка). Поспе этоговсе операции выпопняют анапогично примеру 1,Активность по анипину 0,92 нмопьсубстрата/нмопь цитохрома Рв минпри 37 С (сохранение активности 24%),Активность по аиметипанипину 54,5 нмопьсубстрата/имопь цитохрома Р 450 в минпри 37 С (сохранение активности 110%).Активность цо амиаопирину 26,2 нмопьсубстрата/нмопь цитохрома Рв минпри 37 С ( сохранение активности 190%)Активность по этипморфину 8,4 нмопь1057536 Табпица 1Сохранение монооксигенаэной активности иммобиизованных приразличных значениях рН микросом на попиэтипене с привитойполиакриповой кислотой (субстрат диметипанипин). Монооксигеназная активность микросом иммобипиэованных, % от исходной, при рН 70 81 104 116 . 116 116 104 81 Табпица 2Сохранение монооксигеназной активности иммобипизованных прираэпичном соотношении карбодиимид - попиатипен с привитойпопиакриповой киспотой микросом печени (субстрат - диметипанипин) Монооксигеназная активность иммобипизованных микросом,% от исходной, при соотношение карбодиимид - попиетипен с привитой попиакриповой киспотой 1:20 83,5 1 Скороа Составитепь О. умовадактор Л, Пчепинская Техред М.НадьКорректор М. Шаров Подписна итета СССР ткрытий ская наб., д, 4Тираж Государственно данам изобре Москва, Ж/5 130 иап ППП "Патент, г. Ужгород, уп. Проектная, 4 субстрана/нмопь цитохрома Рв мин при 37 С (сохранение активности 152%),Поспе 4 недепь хранения цри 5 ОС иммобипизованных микросом активность по анипину составпяет 100%, а по ди метипанипину 75% (от опредепенной сразу поспе иммобипиэации).Таким же образом проводят иммобипиэацию фракции микросом на полиэтилене с привитой попиакриповой кислотой (6-10%) с аналогичными соотношениямивсех компонентов, топько с 1,2 г растворимого карбодиимида.Получают анапогичные результаты,Аналогично примеру 1 при укаэанныхв примере 2 количествах растворимогокарбодиимида проводят аммобипиэациюфракции микросом при рН 7,4 и 7,6, Получают результаты, аналогичные приведенным в примере 2,