Способ моделирования снижения активности альдегиддегидрогеназы печени

)5 6 09 В 23/ СУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМИ ГКНТ СССР ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ АВТ(71) Институт биохимии Аский государственный мТУТ, нов,9 Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано для моделирования врожденной сниженной активности альдегиддегидрогеназы (АльДГ) печени крыс с целью изучения механизмов аверсивной реакции и факторов риска сопутствующих алкоголизму заболеваний.Целью изобретения является повышение производительности врожденной патологии,Способ осуществляется следующим образом.После спаривания животных производят исследование вла(злища. 8 мазках определяют наличие сперматоз(лдов, в случае обнаружения которых у самки констатируют 1-й день беременности, При моделированииврожденного снижения активности АльДГ в печени у потомства животных самкам крыс на 11 - 16-й дни беременности вводят однократно внутримышечно пирогенал в дозе 500-625 МПД/кг массы тела. На всем протяжении эксперимента беременных самок . содержат в изолированных клетках на обычном рационе вивария, Родившихся крысят(54) СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ СНИЖЕНИЯ АКТИВНОСТИ АЛЬДЕГИДДЕГИДРОГЕНАЗЫ ПЕЧЕНИ(57) Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть применено при моделировании врожденной ферментопатии, Цель изобретения - повышение воспроизводимости врожденной патологии, Для этого самкам на 11 - 16-й дни беременности однократно внутримышечно вводят пирогенал в дозе 500-625 МПД/кг массы тела, способ воспроизводим у всего потомства. оставляют с самками до 30-дневного возраста, после чего крысят отсаживают от матери и вскармливают до половозрелости на рационе вивария. 8 возрасте 80 - 90 дней крыс умерщвляют декапитацией, Печень замораживают и хранят в жидком азоте до начала анализа. Определение активности АльДГ печени проводят спектрофотометрически по методу Тоттмара с соавторами. Определяют общую альдегидокислящую способность печени в присутствии 5 мМ ацетальдегида, которая отражает суммарную активность всех изоформ АльДГ (митохондриальную, эндоплазматическую и цитозольную с высокой и низкой константой Михаэлиса (К) к альдегидам). Активность внутримитохондриального фермента с низкой К определяют в присутствии 50 мкМ концентрации субстрата. Активность фермента выражают в нмоль НАДН. образовавшегося за 1 мин на 1 мг белка (м О). Достоверность различий между группами оценивают по Т-критерию Стьюдента.В предлагаемом способе моделирования дефекта АльДГ печени крыс на этапе отработки оптимальных его параметров бы 164250755 ло установлено, что наилучший эффект от использования предлагаемого способа регистрировался при введении самкам животных пирогенала на 11 - 16-й дни бе ремен ности в дозе 500-625 М ПД/кг массы тела. Введение пирогенала самкам животных в более ранние сроки их беременности (до 11 дней), когда происходит закладка основных органов, может вызвать появление у потомства врожденных уродств и преждевременную гибель, а в более поздние сроки (свыше 16 дней) - преждевременные роды, оканчивающиеся, как правило, гибелью плода. Доза пирогенала выбрана с учетом того, что введение препарата самкам животных в дозе ниже 500 МПД/кг массы тела не обеспечивает достижения эффекта на снижение активности фермента в печени у потомства животных, а в дозе выше 625 МПД/кг массы тела вызывает патологические изменения в морфологии и биохимической картине крови, что ведет к увеличению уродств и смертности потомства в пре- и постнатальном периоде Сроки забора образцов печени для анализа (80- 90-й день после рождения) обоснованы тем, что, начиная с 60-го дня жизни крысы становятся половозрелыми и активность АльДГ к этому периоду достигает максимального значения.Пример 1. Самке крысы массой 200 г на 11-й день беременности вводили внутримышечно однократно пирогенал в дозе 500 МПД/кг массы тела, С первого дня беременности, подтвержденной наличием сперматозоидов во влагалищном мазке, животных содержали в отдельной клетке на обычном рационе вивария, Роды закончились рождением 7 детенышей, Гибели крысят как в день родов, так и в течение месяца постнатальной жизни не наблюдалось. Спустя месяц после рождения крысят отсадили от матери и вскармливали до половой зрелости на рационе вивария. В возрасте 80 дней из опытной и контрольной групп родившихся крысят (14 шт,) выборочно отобрали самку и самца. Отобранных крыс (4 шт.) забили и произвели забор печени, Печень заморозили и хранили в жидком азоте до начала анализа. Анализ проводили при 23 С. При этом использовали инкубацион,ную смесь следующего состава: на рий-пирофосфатный буфер 50 мМ, рН 8,8, НАД 0,5 мМ; амитал натрия 1 мМ, пиразол 1 мМ. Конечный объем пробы 2 мл. Реакция начиналась добавлением субстрата: 5 мМ и 50 мкМ ацетальдегида. Изменение экстинкции регистрировали спектрофотометрически при 340 нМ, активность фермента расчитывали в нмоль НАДН, образовавшегося за 1 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 мин на 1 мг белка (м О), Концентрацию белка определяли по методу Лоури. Активность фермента, определенная при 5 мМ ацетальдегида, отражает суммарную активность АльДГ с высокой и низкой Км к альдегидам, а при 50 мкМ - только с низкой К к альдегидам - ферменту с основной ролью в метаболизме ацетальде гида.Результаты анализа печени опытных и контрольных животных.Общая активность АльДГ печени у самки и самца (опытная группа) составила соответственно 9,9 и 7,1 м О, а активность фермента печени с низкой Км у этих же животных соответственно 0,9 и 0,7 м О.Общая активность АльДГ печени у самки и самца контрольной группы составила соответственно 7,1 и 7,6 м 0; активность фермента печени с низкой Км ч этих же животных - соответственно 2,1 и 1,0 мО.Пример 2, Самке крысы массой 210 мг на 13-й день беременности вводили внутримышечно однократно пирогенал в дозе 580 МПД/кг массы, а контрольной - изотонический раствор хлорида натрия, С первого дня беременности, подтвержденной наличием сперматозоидов во влагалищном мазке, животных содержали в отдельной клетке на обычном рационе вивария. Роды закончились рождением 5 крысят, Гибели крысят как в день родов, так и в течение месяца постнатальной жизни не наблюдалось, Спустя месяц после рождения крысят отсадили от матери и вскармливали до половой зрелости на рационе вивария, В возрасте 85 дней из опытной и контрольной групп выбооочно отобрали одну самку и одного самца, Отобранных крыс (4 шт.) забили и произвели забор печени. Печень заморозили и хранили в жидком азоте до начала анализа. Определение активности АльДГ печени осуществляли по методу Тоттмара, как описано в примере 1,Результаты анализа печени опытных и контрольных животных.Общая активность АльДГ печени у самки и самца опытной группы составила соответственно 7,1 и 5,8 м О; активность фермента АльДГ печени с низкой Км у самки не обнаружена, а у самца составила 0 5 м О.Общая активность АльДГпечени у самки и самца контрольной группы составила соответственно 16,0 и 13,0 м 0; активность фермента АльДГ печени с низкой Км у этих же животных соответственно 5,2 и 3,6 м О Пример 3, Самке крысы массой 220 г на 16-й день беременности ввели внутримышечно однократно пирогенал в дозе 625 МПД/кг массы, а контрольной - изотонический раствор хлорида натрия. С первого дня1642507 Общая активность АльДГ печени у сам.ки и самца опытной группы составила соответственно 6,8 и 5,6 м О; активность Составитель А.Л ычкова Редактор Л.Веселовская Техред М.Моргентал Корректор Н.КорольЗаказ 1150 Тираж 296 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб, 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 беременности, подтвержденной наличием сперматозоидом во влагалищном мазке,животных содержали в отдельной клетке на обычном рационе вивария. Роды закончились рождением 8 крысят. Гибели крысят как в день родов, так и в течение месяца , постнатальной жизни не наблюдалось. Спустя месяц после рождения крысят отсадили от матери и вскармливали до половой зрелости на рационе вивария. В возрасте 90 дней из опытной и контрольной групп родившихся крыс(14 шт,) выборочно отобрали одну самку и одного самца. Отобранных крыс (4 шт,) забили и произвели забор печени. Печень заморозили и хранили в жидком азоте до начала анализа, Определение активности АльДГ печени осуществляли по методу Тоттмара, как описано в примере 1,Результаты анализа печени опытных и контрольных животных. фермента АльДГ печени с низкой К этих же животных не обнаружена,Общая активность АльДГ печени у самки и самца контрольной группы составила соответственно 11,5 и 9,3 м 0; активность фермента АльДГ печени с низкой К у этих же животных соответственно 2,8 и 2,9 м О.Таким образом, введение самкам крыс на 11-16-й дни беременности пирогенала в дозе 500 - 625 МПД/кг массы тела обеспечивает врожденное снижение активности АльДГ в печени у потомства животных. Формула изобретения Способ моделирования снижения активности альдегиддегидрогеназы печени путем введения лекарственных веществ экспериментальному животному, о т л и ч аю щ и й с я тем, что, с целью обеспечения врожденного снижения активности альдегиддегидрогеназы печени, самкам на 11- 16-й дни беременности однократно внутримышечно вводят пирогенал в дозе 500 - 625 МПД кг массы тела.