Способ определения скорости окисления органических субстратов в микробных суспензиях

,В Буррис Манометриче каневого обм тература", 1 ие меа. М.,1 (проГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТН ОПИСАНИЕ ИЗОБ Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬС(71) Сектор микробиологии АН Азбайджанской ССР(54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕН ТИ ОКИСЛЕНИЯ ОРГАНИЧЕСКИХ ТОВ В МИКРОБНЫХ СУСПЕНЗИЯХ матривающий измерение ско дуцирования двуокиси угле роорганизмЬми, о т л и ч а с я тем, что, с целью уп процесса, перед измерением продуцирования двуокиси уг микробные суспензии помещ лиуретановый носитель, под на стальной проволоке в ст- сосуде с 0,05 0 раствором окиси бария, выдерживают в 5-6 ч,а измерение скорости и ния двуокиси углерода прово титрования 0,.05 й растворо кислоты внрисутствии фенол ИЯ СКОРОС- СУБСТРАпредусрости пророда микющийрощенияскоростилерода ают на повешенный еклянном гидрата течение родуцировадят путем м соляной Рфталеина, .45 На чертеже показан предлагаемыйприбор. Изобретение относится к микробиологи.и и касается способа определения скорости окисления органических.субстратов в микробных суспенэиях,основанного на определение СО,выделяемого при окислении органического субстрата, и может быть использовано в научных исследованияхпри изучении биохимических особенностей микроорганизмов, а также в промышленности, например в. очистных (Осооружениях нефтехимических и других производств при изучении биологической активности и эффективностиработы ила.Известен способ определения ско- (5рости окисления органических субст-;ратов в микробных суспензиях по измерению скорости продуцирования двуокиси углерода (СО)методом, газовойхроматографии(1).20Недостатком этого способа являет- .ся сложность используемой для анали-за аппаратуры,Наиболее близким к предлагаемомупо технической сущности и достигаемому эфФекту является способ определения скорости окисления органических субстратов в микробных суспензиях, предусматривающий измерениескорости продуцнрования двуокисиуглерода микроорганизмами, Согласно 3"способу измерение образования СОпроводят манометрическим методомв сосудиках Варбурга Г 23Однако гаэообмен осуществляетсяв замкнутом пространстве, в результате поглощения кислорода изменяется газовый состав среды, результатом чего является возможное снижение скорости окисления субстратаво времени. Конструкция аппарата 40Варбурга такова, что не дает воэможности одновременного изученияболее 6 субстратов, что ограничивает его возможности.Цель изобретения - упрощениепроцесса.Поставленная цель достигаетсятем, что согласно способу определения скорости окисления органическихсубстратов в микробных суспензиях,предусматривающему измерение скорости продуцирования двуокиси углеродамикроорганизмами, перед измерениемскорости продуцирования двуокисиуглерода микробные суспензии помещают на полиуретановый носитель, 55подвешенный на стальной проволоке встеклянном сосуде с 0,05 И раствором гидрата окиси бария, выдерживают в течение 5-6 ч, а измерение скорости продуцированиядвуокиси углеро да проводят путем титрования 0,05 Яраствором соляной кислоты в присутствии фенолфталеина,Прибор состоит из стеклянной цилиндрической колбочки 1. объемом 25 мм, в которую подвешивается нанизанная на стальной проволоке 3 полоска полиуретановой губки 2 размером 30 х 8 х 8 мм, Стальная проволока 3 укрепляется в резиновой пробке 5 через которую проходят стеклянная трубка 4, наполненная натронной известью. Она предназначена для соединения газовой фазы колбочки с наруж-, ным воздухом. Натронная известь пропускает в колбочку кислород, нопоглощает углекислоту. Суспензия микроорганизмов объемом 0,1-0,2 ммвпитывается в боковые грани полиуретановой губки, органический субстрат добавляется на верхнюю, горизонтальную грань губки. В колбочку наливает. ся 2 мл раствора 0,05 И Ва(ОН), Полоски полиуретана с суспензией микроорганизмов подвешиваются в колбочке и экспонируется в термостате при 30 С 5-6 ч. При постановке опытаонеобходимо следить, чтобы пробка 5 плотно прилегала к горлу колбочки 1 Определение выделившегося и поглощенного раствором гидрата окисибария СО осуществляют методом титрования 0,05 И раствором НС 1 в присутствии Фенолфталеина. Для определения СО., имеющегося в воздухе, ставят контрольную колбочку без суспензии микроорганизмов.Об окислении органического субстрата и окислительной активностимикроорганизма судят по интенсивности продуцирования СО в присутствии данного субстрата.Определение окислительной активности проводят для двухсуточных культур микроорганизмов, выращенных на жидких или агаризованных органических или минеральных средах. Культуры отмываются три раза буфером со значениями рН, соответствующими Физиологическим,особенностям данного микроорганизма, впитываются в полоску губки и экспонируются в колбочках в присутствии Ва(ОН).Через 5-6 ч путем титрования 0,05 ИНС 1 в присутствии фенолфталеина определяется количество выделившеГося СО по формулеА-В . 0 05 44 (мг/АСВ/ч),пгде А = мл 0,05 Б Ва(ОНЬ, налитое вколбочку (2 мл);В = мл 0,05 И НС 1, пошедшее натитрование;0,05 - нормальность раствора Ва(ОН);44 - мг-эквивалент СО,и - вес биомассы, добавленной вгубку;С - время экспозиции;АСБ - абсолютно сухая биомасса,Количество выделившегося СО представляют в мг на 1 мг сухой биомассы3 1035064 конец полоски не долйен сопрюкасаться с поверхностью раствора Ва(ОН),Одновременно с опытными колбами,ставятся контрольные без микробнойсуспензии дпя учета углекислого газа воздуха в колбочке. Колбочки.экспонируют в термостате при 2830 С 5 ч. Колбочки, в эжт периодиногда осторожно встряхивают. Поокончании времени экспозиции в кол бочки добавляется капля фенолфталеи-.на и избыток гидрата окиси бариятитруется 0,050 раствором солянойкислоты до обесцвечивания, По разнице между титрованием контроля и 15 опыта определяется количество выделившегося углекислого газа микробной суспензией, Интенсивность продуцирования СО выражается в мг на1 мг сухой биомассы за 5 ч. Ошибка 2 О определения до 3-5. Мл0,05 ННС 1прошло натитрова. -ниеа С вычетомконтроляЬ Ь 2-а .Варианты мг мл Контроль 1,95 0,05 Эндогенное( безсубстратное) 0,250,20 0,71 0,66 1,75 0,22 112 н -ГексадеканТолуол 1 1,29 0,726 372е146 1,69 0,31 0,26 0,2860,9900,9350,22 Зтилбензол 1,05 0,950,90 507 Н-ГексилбензолБензол 0,85 0,9 479 1,75 112 025 Оу 20 Как видно иэ таблицы, дрожжи С.дц 1111 енпопЖ 1 916 способны окислять все углеводороды, хотя с различной интенсивностью, Лучше всех окисляются этилбензол и н-гексилбензбл, далее следует н -гексадекан. Толуол окисляется слабее, бензол не окисляется совсем.П р и м е р .22-суточная культура бактерий Ряецйощопая аегцд 1 пояа шт. 7, выращенная на мясо-пептонном 60 агаре, смывается с поверхности среды и отмывается три раза фосфатным буфером рН 6,8 на центрифуге. ПоАученные клетки разводят буфером для получения бактериальной суспензии за 1 ч. Абсолютно сухую биомассу можно выразить также содержанием азота, в этом случае количество СО выражают в мг на 1 мл азота за 1 ч,Делением весового значения СО 2 на 0,00195 можно получить объемные значения СО в микролитрахл).П р и м е р 1 . 2-суточная куль,тчоа дрожжей СапйЫа дц 1111 егвопй 11 916,выращенная на сусло-агаре,смыва- ется с поверхности среды и отмывается три раза Фосфатным буфером рН 5,4. Полученную пасту разводят тем же . буфером для получения суспензии с оптической плотностью Р = 1,2-1,5 0,2 мл (1 мг) этой суспензии впитывается в полоски поролона, предварительно надетого на проволоку. На верхнюю часть полоски добавляются 0,02 мл и-гексадекана. В колбу добавляется 2 мл раствора 0,05 Н Ва(ОН). Резиновой пробкой с проволокой и надетой на проволоку полоской поролона плотно закрывают колбу та" ким образом, чтобы полоска поролона была полностью в колбочке,.нижний В таблице показано продуцирование СО клеточными суспензиями дрожжей С, дц 1111 еппоис 111 ВКМ 4-916 мг, ми на /1 мг сухих клеток /5 ч)с оптической плотностью Р = 01,52,0, Суспензия в количестве 0,2 мл(0,05 мг) вносится на поверхностьпоролоновых полосок, надетых предварительно на стальную проволоку врезиновой пробке, На верхнюю частьполоски добавляется 0,02 мл псевдокумола. Помещают полоску в колбочку,куда предварительно вливается 2 мл0,05 Б раствора ВаОН)р,.плотно закрывают пробку, колбочки выдерживают в термостате 5 ч при 30-32 С.По окончании экспозиции в колбочкахопределяется содержание виде,пившегося СО по методу, описанному в1035064 Составитель В.ГолимбетРедактор Л.Авраменко Техред М, Костик Корректор В.Бутяга Заказ.5759/23 Тираж 523 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Рауыская наб., д. 4/5 Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Использование предлагаемого способа определения скорости окисления органических субстратов в микробных суспензиях обеспечивает по сравнению с известным способом сле дующие преимущества: определение окисления органических субстратов значительно упрощается, так как предлагаемая конструкция прибора проста и доступна любой лаборатории создается воэможность проведения анализа не только в лабораторых условиях, но и непосредственно в полевых условиях, в экспедиции; отпадает необходимость в приобретениисложного и дорогого оборудования;в аппарате Варбурга при наличии полного набора манометров возможно одновременное изучение окисления неболее б органических субстратов.Приборов предлагаемой конструкцииможно изготовить в количестве необходимом для изучения одновременно 10 неограниченного количества субстратов, что значительно экономит,время.Ф