Способ получения вакцины таежного весенне-летнего энцефалитного вируса

ОП ИСАНИ ИЗОБРЕТЕН И Союз СоавтсмикСоциалистичвскикРвспубпин 738 К ПАТЕНТУ онолнительиый к патенту 22) Заявлено 21.12.79(21) 2854825/2(33) Австрия СССРевам нэееретеннй бликов 07.03. 833 юллетен 615.372 088.8),отнрытин ата опубликования описания 07 ИностранцыФранц Хайнц, Кристиан Кунц, Йохан(Австрия)) Заявитель Иностранная "Иммуно АГ фюр Хемиш(Авст рмаеаици 54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЕСЕННЕ-ЛЕТНЕГО Э ИНЫ ТАЕ)КНОГОАЛИТНОГО ВИРУС бретение относи тся к произвоц вируссодержашую жиакость инактиви 1,формалином или бета-пропиолактоном,затем обрабатывают протаминсульфатоь,очистку осуществляют при непрерывномцентрифугировании с градиентом, плотнооти сахавозы от 0 цо 50%, отбираютфракции, имеющие повышенную экстинкциюпри 260 нм н соцеркашие частицы сконстантой сециментации в области .а 2005 и полученные фракции разводятбуферным раствором, преимущественно,фосфатным буферным раствором рН 7,6,Кроме гого, с целью стабилизациицелевого продукта фракции разводят15 буферным раствором, соцержашим 0,1%человеческого альбумина.Способ осушествляют слецутошим образом. ству вакцин. Известен с б получения вакциныфалитного энцениянзи ьтивиро вируса путем к культуре ткани нальных клеток делением вирусс рифугированием получением цел и эмбриоюшим откости центвируса и или в сусле птиц с последу одержашей жиц инактивацией евого продукта Однако известный способ не обеспевает высокой чистоты целевого процук Целью изобретения является повышение чистоты целевого продукта,Поставленная цель достигается тем,что при осуществлении способа получениявакцины таежного весенне-летнего энцефалитного вируса путем культивированиявируса в культуре ткани или в суспензии;шим отделением вируссоцержашей жидкос ти центрифугированием, инактивациейвируса и получением целевого и наи 199 ициру при в пре ей. тки кур суслеы клеток ТСИцттт 199), инфв суспейзиии температуречение 1-5 дн роцукта ежного весенне-летнег Эмбриональные кле 1 руют в среде культур(6 мое СоИмте Мед ют вирусом и держат аэробных условиях пр делах 25-38 С в те3 1003"138 4Затем клегки и осгагки клеток огаеляюг повышенную, а фракпия 11 максимальнуюпутем центрифугирования, Полученную экстинкдию. В этой фракции находятсясуспензию вируса инактивируюг с попочти исключигельно частицы вируса смощью формалина или 3 -пропиолактона константой седиментации 2005 беэи после этого концентрируют путем ультра-. дедименгируюших заметно быстрее илифильтрации. Стадии инакгивапии и конпен- медленнее чем вирус примесей. Пик сотрирования можно также проводить в об- ответствуег конаентрадии сахароэы 39%.ратной последовательности. Суспензия Другой пик у фракции номер 25, соотгнаряау с ТВЛЭ-вирусом содержит раз-ветствукиай концентрации сахароэы меличные примеси, которые седиментируюг Ф иее чем 10%,указывает на наличие причасгично быстрее или меаленнее чем месей,которые отбрасываются. На диаТВЛЭ-вирус, Предпочтительно отделяют грамме наглядно показано относительноебыстрее седименгируюшие части путем протективное действие (определенное восаждения с помощью протаминсульфата, прямом опыте защиты мышей) отдельныхпрежае чем осуществляют собственныйф фракций с помощью различной высоты конепрерывный способ ульграценгрифугирова- лонн,фракция 11, следовательно, имеет,ния с распределением градиентов плогноо- самое высокое относительное защитноети. действие.Способ, в частности, осуществляют Собранные содержащие вирус фракциитаким образом, что в роторе ультрадентри ЗЕ теперь предпочтительно разбавляют буфефуги, наполненном расгвором буфера, ром, содержащим человеческий альбуминцелесообразно раствором фосфагного буфе- аля того, чтобы улучшить стабильностьра, при 3000 оборотов в минуту полови вирус ангигена, и затем.обычным спосона буферного раствора вытесняется 50%- бом перерабатывают палее в вакцины.ным раствором сахарозы, и образуется уЗ Полученные вакцины имеют более высоблагодаря этому градиент плотности кую чистоту и лучше переносятся челове 0-50% сахарозы. После этого суспензия, ком, чем препараты, изготовленные обычсодержащей вирус, ааюг стечь через ро- ным способом.тор при скорости вращения рогора 35000 В таблице приведены. сравнительныеоборотов и минуту со скоростью, исге- уй реэульгагы переносимости препаратов,чения предпочтигельно 3 л/ч. При выб- полученных известным и предложеннымраиных условиях большая часть вирусных способами, причем в первой граф привечастиц входит в градиенты плотности. цены реакции с вакцинами, изгоговленныКак только весь материал прошел аппарат, ми известным способом, а во второйиенгрифугируюг еще один час причем графе - реакции с вакцинами, полученныУЗЗодновременно дают протекать раствору ми предложенным способом, В случае прифосфатного буфера. Затем осторожно про- вивок с помощьв полученных согласноводят ротор в состояние покоя и соаер- изобретению вакцин не могли наблюдатьжимое его разделяют на отдельные фрак ся никакие нежелательные реакции - иидни. После этого в каждой фракции опре- локальные, ии системные.Яеляют экстянкдив при 260 нм и одно- ные реакции ни локальные, ни системвременно устанавливают содержание са ные.харозы во фракции. Локализация вируса Полученные согласно предложенномув градиентах плотности делается воэмож способу вакцины отличаются неэначительной благодаря его экстянкции при 260 нм, ным соаержаняем протеина, не принимая43Вирус связывается в области при содер- во внимание добавленный человеческийжанни сахарозы примерно 40% и обуслад . альбумин, Это содержание протеина приливает здесь отчетливое увеличение эко- равном антигевйом действии во многочяикдии при 26 О нм. раз (по меньшей мере в 10) меныпе,чем в случае ао сих пор применяемыхЙа чертеже представлена диаграмма фф препаратов.этой зависимостиоткуда видна экстиикци П р и м е р,. Суспеиэив эмбриональеотдельных фракций по отношению к гра- иых клеток кур в ТСМ 199 (ТЭЗ 50 Е. диенгам плотности. Градиент плотности культура-среда) инфицяруюг ТВЛЭ-вирураствора сахароэы составляет 0-50%. сом, После выдержки в течение 4 сугШгрихпункгирная кривая показывает рао- фф при 33 С содержащую вирус суспенэиюпреаеление экстиикции щж 260 нм в оз- собирают и центрифугированием придельных фракциях. В области около 40% 3000 г в течение 15 мин при 4 С огсахарозы фракции 10, 11 й 12 имеютаелявт клетки,.концентрацией сахара около 40% объеаиняюг и разбавляют до 1:10 фосфагнымбуферным солевым раствором при значении рН 7,6, в котором содержится 0,1%человеческого альбумина,Защитную активность полученного преаложенным способОм препарата определяют в прямом защитном опыте на мьпиах.Подвергаемый исоледованию препаратразбавляют (1:3;1:9 1:27; 1:81; 1:243)и смешивают с 0,2% гиароокиси алюминия,примененной в качестве средства, усидвваюшего действие црепарага, При примененни в каждом случае 0,2 мл указанныхразбавленных растворов 2 раза с промежутком в 1 неделю поакожно иммунизируюг по 10 мышей .(весом примерно по10 г). Через две последующие недели,мышей инфицнруюг 100-1000 ЬЪоТВЛЭ-вирусом и рассчитывают защитнуюдозуЬЭ .по методу Рида и Мкнха посленаблюдения в течение 3 недель.При этом защигную дозу Фр опре:деляюг при разбавлении 1:ЗО. окальна До 72 6 Общие реакции (головная боль, усталость),% До 64 Повышенная температура теда (объем 37,3-38 оС 38-39 С Выше 39 С 1914 До 68 До 36 До 27 5 10037К полученной суспенэии вируса прибавляют формалин в гаком количестве,чтобы конечное разбавление составляло1:2000, и затем суспенэию выдерживаютв течение 30 мин при 37 С и 48 ч при ккомнатной температуре,Затем инактивированную суспензию вируса смешивают с 0,5 мг/л протамиисуль-фата и смесь выдерживают в течение ночипри 4 С, Образовавшийся осадок отделяют 1 фпосредством цеитрифугироваиия цри10000 г в течение 30 мин при 4 С.оПреаваригельно обработанная указаннымспособом суспензия представляет собойисходный материал для непрерывногоульграценгрифугирования в градиентеплотности.Суспензию вируса со скоростью потока 3 л/ч пропускаюг с помощью насосачерез центрифугу, в которой в качестве фйсахардэного градиента плотности содержится 0-50% сахароэы в фосфагном буферном солевом растворе при рН 7,6,Обьем составляет 4,5 л, время центрифугирования 1,5 ч. После остановки ффцентрифуги содержимое ротора выкачиваюг и при этом разделяют на 16 фракцийпо 100 мл. Для каждой отдельной фракции опреаедяюг экстинкцию при 260 нмна спектрофотометре и удельную плотность, рфна рефракгомегре. При этом наблюдаетПредложенный способ позволяет повысить чистоту и стабильность вакцинытаежного весенне-летнего энцефалигного,вируса.,7 1003738 8 ф о р м у л а и з о б р е т е н и я; от 0 по 50%, отбирают фракции, имею 1. Способ получения вакцины таежного шие повышенную экстинкцию при 260 нм весенне-летнего энцефалитного вирусаи соцержашие частицы с константой путем культивирования вируса в культуре сепиментации в области 2008 и получен- ткани или в суспензия эмбриональныхные фракции развоцят буферным раствором, клеток птиц, с послепуюшим отцелением преимушественно фосфатным буферным вируссодержашей жипкости ценгрифугйро- раствором рН 7,6. ванием, инактивацией вируса и получе, Способ пс. и. 1, о т л и ч а юнием целевого продукта, о т л и ч а ю - ш и й с я тем, что, с целью стабилизаш и й с я тем, что, с целью повышения р ции целевого продукта, фракции развоцят чистоты целевого процукта, вируссоцержа- .буферным раствором, соцержашим 0,1% шую жипкость инактивируют формалином человеческого альбумина. йи бета-пропиолактаном, затем обраба Источники информации, тывают протаминсульфатом, очистку осу- принятые во внимание при экспертизе шествляют при непрерывном центрифугиро. Патент Великобритании ванин с грациентом плотности сахарозы Мг 1453035, кл. А 5 В, 1977,60 дщ 1 тт Ссставитель С, Малютиналексеенко Техред А,Бабинец Корректор С, Шекмар ецактор Зак 588 Г 49 Тираж 711 ВНИИПИ Госуаарственного комитета СС по пелам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская набц.ПоцСР иал ППП Патент, г. Ужгороц, ул. Проектная, 4