Способ получения нуклеозидов

(и)942186 Союз СоветскихСоциалистическихРеспублик ОП ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(51)М. Кл,С 12 Р 19/38 (С 12 Р 19/ЗВ С 12 Р 1/04) (53) УДК 663.1(088 8) Ркударатееяяий коиятет СССР ао аелаи язееретеяяй я отарытяй(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НУКЛЕОЗИДОВ Изобретение относится к биохимии, а именно, к способу получения нуклеоэидов, которые применяются в медицине и научных исследованиях.Известен способ получения нуклеозидов, предусматривающий гидролиз РНК ферментными препаратами, содержащими нуклеаэы и фосфатазы, при нагревании с 11то В качестве ферментных препаратовиспользуют внутриклеточные ферменты,что усложняет процесс их получения,Кроме того, необходима активация ферментов, разрушающих нуклеозиды. Выход нуклеозидов составляет 513.Цель изобретения - увеличение выхода нуклеозидов и упрощение процесса,20Указанная цель достигается тем,что в способе получения нуклеозидов,предусматривающем гидролиз РНК ферментными препаратами, содержащими нуклеаэы и фосфатазы, при нагревании, в качестве ферментного препарата используют внеклеточные ферментымикроорганизма Асс 1 пощусеэ сое 11 со 1 огА, при этом гидролиэ ведут при37-40 оС, рН 8-9,1 в присутствии хлористого магния в концентрации 1 105 -10 М, Штамм Асй 1 пощусеэ сое 11 со 1 огА зарегистрирован во "ВНИИгенетика" под коллекционным номером"ЦМПМ 5-464" и имеет следующие морфологические и физиологические характеристики,На твердой среде, содержащей осахаренные амилазой пшеничную муку икрахмал, соли, мицелий имеет видочень тонких разветвленных гид. Стенки клеток мицелия прямые. Ширинаклеток мицелия 0,71-0,93 ммк. Спороносцы спиральные, с 1-3 завитками,нередно с примитивными спиралями,расположенными моноподиально, одиночные. Споры.овальнйе, шаровидные,с гладкой оболочкой.5 1 О 15 20 25 эо Э 5 до 50 55 Колонии неправильной округлойформы, края неровные, воздушныймицелий слабый, колонии серого илирозовато-красного цвета. Диаметргигантской колонии на 10-е сут роста 10- 12 мм. Среда не буреет, пигмент в среду не выделяется.На агаризованной среде Чапекас 33 сахарозы рост слабый, растеттонкой почти прозрачной пленкой.Колонии круглые, поверхность ровная,воздушный мицелий слабо развит, светло-розового цвета, диаметр колонии6-7 мм,На крахмал-аммиачной среде ростслабый, тонкой пленкой, среда неокрашена, диаметр колонии 3-4 мм,На МПА образует небольшие колонии неправильной формы диаметром7-8 мм растет в виде тонкой морщинистой пленки, в центре колонии слегка выступающей над поверхностью агара.Края колонии неровные, воздушныймицелий скудный, неокрашенный, сре, да не буреет.На сусло-агаре растет хорошо ввиде мощной морщинистой пленки кремового цвета. Воздушный мицелий отсутствует, колонии круглые, краяволнистые, диаметр 12-15 мм.На картофельно-пептонном агарерост хороший, колонии в виде морщинистой пленки, окрашенные в красновато-розоватый цвет, Края колонииволнистые, диаметр 6-7 мм, воздушныймицелий скудный белого цвета.На синтетической среде растетхорошо в виде небольших колоний диаметром 6-7 мм. Колонии гладкие, вцентре слегка морщинистые, края неровные, колонии бесцветные или слегка розоватые.На ломтике моркови рост слабый вместе укола; на ломтике картофелярост слабый, в верхней части столбика в виде морщинистой пленки кремового цвета; мясо-пептонную желатинуне разжижает; молоко хорошо пептонизирует на 10-е сут. Нитраты невосстанавливает,Оптимальная температура роста370 С - рост хороший в нижней частикосяка в виде морщинистой пленки.При 50 С - рост отсутствует,Отношение к углеводам: крахмалгидролизует, сахара употребляетс подкислением среды,П р и и е р 1, 5 л культуральнойжидкости, полученной в результате культивирования микроорганизмаАсспощусез сое 1 соог А подвергают сепарации, Получают 4 л спернатанта с активностью нуклеазы170 ед/мл.100 г рибонуклеиновой кислотырастворяют в 1 л воды при подщелачивании водным раствором аммиакадо рН 9,1. К полученному растворуРНК добавляют 4 л фильтрата культуральной жидкости и снова доводятрН реакционной смеси до 9,1. Затемдобавляют 5 г хлористого магния иустанавливают температуру реакционной среды 39 ОС. Выдерживают 10 чпри 37-40 С и 89-9, при постояноном перемешивании рН поддерживаютдобавлением раствора аммиакаПослеокончания ферментативной реакциигидролизат содержит, г: гуанозина18,0, аденозина 15, цитидина 9,1,уридинаОбщее количество нуклеозидовопределенное методом ионообменнойхроматографии, составляет 56,1 от .РНК,П р и м е р 2, Используют супернатант, полученный как в примере 1,с нуклеазной активностью 300 ед/мл.100 г рибонуклеиновой кислоты растворяют в 1 л воды при подщелачивании 2 Н гидратом окиси натрия до рН 8,7, добавляют 4 л супернатанта культуральной жидкости, полученному, как в примере 1, с активностью 300 ед/мл и снова доводят рН реакционной среды до 8,7, Затем добавляют 5 г хлористого магния и выдерживают 6 ч при 37-40 С и рН 8 5-8,7 при постоянном перемешивании рН поддерживают добавлением 2 Н раствора гидрата окиси натрия. После окончания ферментативной реакции гидролизат содержит, г: гуанозина 18,8, аденозина 16 цитидина 9,2, уридина 14,7 Общее количество нуклеозидов 58,7 Г, от РНК.Предлагаемый способ позволяет увеличить выход .нуклеозидов, упростить процесс получения и сократить его длительность,формула изобретеня Способ получения нуклеозидов, предусматривающимгидролиз РНК ферментными препаратами, содержащими нуклеазы и фосфатазы, при нагрева5 947 нии, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью увеличения выхода нуклеоэидов и упрощения процесса, в качестве ферментного препарата используют внеклеточные ферменты микроорга.- низма Асй 1 поаусез сое 11 со 1 ог А, при этом гидролиз ведут при 37-40 оС,186врН 8,0-91 в присутствии хлористогомагния в концентрации 510 - 110м.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Патент Японии В 47-27037,кл. 16 Е 611.2, 1972.1Подписное Заказ 5527/39 Тираж 505 ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Рауаская наб., д. 4/5