Способ получения ферментного комплекса

и 943279 ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДВТЕЛЬСТВУ Союз СоветскихСоциалистическихРеспублик(22) Заявлено 05 08. 80 (21) 2970009/28-13с.присоединеиием заявки Мо Р 1 М К з С 12 Н 9/22 Государственный комитет СССР но делам изобретений и открытийОпубликовано 1 Ь 0782,Бюллетень М 2 б Дата опубликования описания 15. 0782(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНОГО КОМПЛЕКСА Изобретение относится к способам получения ферментного комплекса, используемого для расщепления нуклеиновых кислот до нуклеотидов и нуклеозидов, которые находят широкое применение в медицине и научно-исследо,вателькой работе в биохимии и молекулярной биологии.Ферментные комплексы, расщепляющие нуклеиновые кислоты, содержат ферменты типа нуклеаз и фосфатаз и получают как выделением из растительных и животных тканей, так и микробиологическим путем. Наиболее перспективными являются микробиологические способы.Известен штамм Асс 1 повусез соек 1- со 0 ог А-бб,продуцнрующий ферментный комплекс, йоторый содержит 5-экзонуклеазу, фосфатазу и другие ферменты, причем активность 5-экзонуклеазы в условиях глубинного культивирования 400 ед/мл, а при культивировании в производственных условиях в ферментере.- 600 ед/мл Ц .Однако активность фосфатаэы в комплексе очень низкая, в то же вре-. мя он содержит высокоактивную дезаминазу, которая дезаминирует нуклеотиды, прн этом сильно снижается выход целевого продукта - аденози= на и гуанозина.Известен также способ получения5-экзонуклеазы, включающий культивирование Асс 1 повусез соес 1 совог шт Апри 28-30 С и рН 6,9-7,2 на жидкой питательной среде, содержащей.пшеничную муку и крахмал, прогидролизованные Ю-амилазой, серно- кислый аммоний, мел и калий хлористый, и выделение фермента иэ культуральной жидкости осаждением органическим растворителем, в котором соотношение с-амилаэы к пшеничной муке 0,5 г:40 г, мука, крахмал, сульфат аммония, мел и калий хлорнстый взяты в соотношении 2: 2:О, 610, б: О, 1 .Время культивирования 48 ч прн 30 оС и аэрация 1 объем воздуха на 1 объем среды. Актилность 5-экзонуклеазы в культуральной жидкости 400 ед/мл. Ферментный препарат из фильтрата культуральной жидкости осахрают 2,5 объемами ацетона при рН 25 5,5 в присутствии магния хлористогофосфатазы и низкой ее активностью (следы), обусловленные недостаточным количеством катионов К+ в питательной среде, а также длительностью культивирования (48 ч), в связи стем, что гидролиз пшеничной муки и крахмала при соотношении,с-амилазы ГхЗХ к пшеничной муке 0,5 г на 40 г муки проходит не до конца и не создает необходимое содержание олигосахаридов в питательной среде, что замедляет рост биомассы и продуцирование ферментов.,Цель изобретения - повышение фосфатазной активности ферментного комплекса при сохранении высокой активности 5-экзонуклеазы, а также сокращение сроков культивирования продуцента.Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения ферментного комплекса, содержащему 5 -экэонуклеазу и фосфатазу, включающему культивирование Ас 1 повусев. сое 61 соРот шт Апри 28-30 С и РН 6,9-7,2 на жидкой питательной среде, содержащей пшеничную муку и крахмал, прогидролизованные Ю- амилазой, сернокислый аммоний, мел и хлористый калий, и выделение ферментов из культуральной жидкости путем осаждения органическим растворителем, в питательную среду дополнительно вводят активатор ферментов - хлористый марганец в концентрации 0,001-0,002% и пеногасительсиликоновое масло, при этом весовое соотношение с(,-амилазы к пшеничной муке составляет 1:(14-17), соотношение муки, крахмала и хлористогокалия соответственно 1:(0,6-0,7): :(0,07-0,08), а осаждение конечного продукта осуществляют этиловым спиртом при соотношении культуральной жидкости и спирта 1:(3,5-4,5).Введение в питательную среду марганца хлористого в концентрации 0,001-0,002 активизирует и стабилизирует Ферменты 5 -экзонуклеаэу и щелочную Фосфатазу в процессе их биосинтеза и выделения из культуральной жидкости. Использование силиконового масла в качестве пеногасителя имеет то преимущество, что оно не обволакивает клетки мицелня и не мешает выходу ферментов из ,клетки, что способствует увеличению концентрации 5 -экзонуклеазьт и щелочной фосфатазы в культуральной жидкости. Проведение процесса гидролиэа К-амилазой при соотношении а(.-амилазы к пшеничной муке 1:(14-17) приводит к более полному разложению полимерной молекулы полисахаридов на олигосахариды, нвокрашиваемые йодом. Обогащение питательной среды олигосахаридами сокращает лаг-фазу и время максимального накопления ферментов, чтоупрощает процесс получения ферментного комплекса за счет сокращениядлительности культивирования на 812 ч. Соотношение пшеничной муки::крахмала:калия хлористого 1:(0,60,7):(О, 07-0, 08) приводит к обогащению питательной среды аминокислотами и катионами калия, Это увели- )О чивает количество биомассы и активирует продуцирование ферментов5 -экзонуклеазы и щелочной фосфатазы.Осаждение ферментного комплек са этиловым спиртом при соотношениикультуральной жидкости к спирту1:(3,5 4,5) приводит к более полному осаждению щелочной фосфатазы изкультуральной жидкости и обогащению 20 Ферментного комплекса Фосфатазой.П .р и м е р 1. 15 кг пшеничноймуки, разведенной в воде, заливаютв ферментер, включают мешалку, доводят объем до 200 л и проводят стерилизацию муки острым паРом прн2 кгс/см в течение 2 ч. По окончании сгерилизации давление в аппарате опускают, охлаждают до -95 С изагружают 10 кг растворимого крахмала, 0,9 кг К-амилаэы (амнлосубтилинаГЗх) и проводят осахаривание. Затемзагружают остальные компоненты, кг:аммоний сернокислый 31 мел 3; калий хлористый 1,05; марганец хлористый 0,005; силиконовое масло0,20. Доводят объем до 500 л водой,РН среды 6,9. После загрузки всехкомпонентов питательной среды ферментер герметически закрывают истерилизуют подачей пара в рубаш ку при 1 кгс/см в течение 1 ч.После окончания стерилизации 12 литров трех суточной глубинной культуры Аст.1 пощусез сое 91 собог шт. А вливают в ферментер, включают мешал ку и подают стерильный воздух вферментатор для аэрации. Процессферментации проводят при 29-30 С,давление в ферментере 0,5 кгс/см 1расход воздуха 30 мэ/ч при размешивании мешалкой со скоростью300 об/мин, Выращивание ведут 40 ч.По окончании ферментации культуральную жидкость фильтруютПолучают450 л фильтрата культуральной жидкости. В фильтрат добавляют 450 гмагния хлористого и доводят РН до5,5 с помощью 5 н. НС 0. К охлажденному фильтрату культуральной жидкостиприливают 3,5 объема охлажденногодо 40 С этилового спирта и сушат ввак 1)ум-слаильных шкафах. Активность5 -экзонуклеазы 44300 с/г. Активностьщелочной фосфатозы 910 с/г препарата.П р и м е р 2, К 18 кг пшеничной 65 муки в 200 л воды, простерилиэованной943279 формула изобретения Составитель Е.ВоробьеваРедактор Н,Киштулинец Техред Ж. Кастелевич КорректорИ.МУска Подписное Заказ 5037/34 Тираж 505 ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений.и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 в ферментере острым. паром при2 кгс/см добавляют 12,6 кг крахмала и 1,3 кг амилосубтилина ГЗх и проводят осахаривание. Затем загружают остальные компоненты, кг: аммоний сернокислый 3,6; мел 3,6; калий хло ристый 1,5; марганец хлористый 0,0075; силиконовое масло 0,3. Доводят объем до 500 л водой, рй среды 7,2, 12 л трех суточной глубинной культуры АсС 1 пощусев сое 01 соЮог шт. 10 Авливают в приготовленную питательную среду и подают стерильный воздух для аэрации при включенной мешалке.Процесс ферментации проводят при (5 29 ОС и давлении в ферментере 0,5 кгс/см 1, расходе воздуха 30 м/ч при размешивании мешалкой 240 оЬ/мин. Выращивание ведут в течение 36 ч. Активность 5 -экзонуклеазы в культуральной жидкости 480 ед/мл.20Культуральную жидкость фильтруют, Получают 460 л Фильтрата культуральной жидкости. К культуральной жидкости добавляют 460 г хлористого магния и доводят рН до 5,5 с помощью 5 н. НС 6. К охлажденному фильтрату культу- ральной жидкости приливают охлажденный этиловый спирт в соотношении 1:4,5 при перемешивании. После отстаивания в течение 20 мин суспен.зию фильтруют на нутч-фильтре. Осадок фермента промывают этиловым спиртом и сушат в вакуум-сушильных шкафах. Активность 5 -экзонуклеазы 50100 е/г препарата. Активность щелочной фосфатазы 1020 е/г препарата.Предлагаемый способ позволяет повысить активность Фосфатазы в продуцируемом ферментном комплексе 4 при сохранении высокой 5 -экзонук(леазной активносн(, а также сократить сроки культивирования продуцента. Способ получения ферментного комплекса, содержащего У -экэонуклеазу и Фосфатазу, включающий культивирование Ас 1 пощусев соеР 1 сойог шт Апри 28-ЗООС и рн 6,9-7,2 на жидкой питательной среде, содержащей пшеничную муку и крахмал, прогидролизованные сС-амилазой( серно- кислый аммоний, мел и .хлористый калий, ивыделение ферментов из культуральной жидкости путем осаждения органическим растворителем, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что с целью повышения фосфатазной активности ферментного комплекса при сохранении высокой активности 5 -экзонуклеазы, а также сокращения сроков культивирования продуцента, в питательную среду дополнительно вводят активатор ферментов - хлористый марганец в концентрации 0,001- 0,02 и пеногаситель - силиконовое масло, при этом весовое соотношение д.-амилазы к пшеничной муке составляет 1:(14-17), соотношение муки, крахмала и хлористого калия соответственно 1:(О, 6-0, 7)0,07-0,08), а осаждение осуществляют этиловым спиртом нри соотношении культуральной жидкости и спирта 1:(3,5-4,5). Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Авторское свидетельство СССРР 772224,кл. С 12 И 15/00, 1979,2. Авторское свидетельство СССРпо заявке М 2659534/28-13,кл, С 12 О 13/10, 1978 (прототип),