Способ определения таксономической принадлежности микроорганизмов

С 0103 СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ У 44(4 о-исследоватеического прибо научоло Ьеппз 1 гу, 198 АКСОНОМИЧЕСООРГАНИЗМ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ ССС ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТ(71) Всесоюзныйский институт бистроения(56) 3. Апа 1 у 1 са 157, р, 1669-1673,(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕКОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ МИК(57) Изобретение относится к микро"биологии, Цель изобретения - ускорение способа. Исследуемую суспензиюмикроорганизмов разделяют на несколько проб, в которые добавляют различные флуорогенные субстраты, расщепляемые внутриклеточными ферментами микроорганизмов. После инкубации определяют величину флуоресценции каждойпробы, строят профиль исследуемой сус.пензии и сравнивают с контролем, выбирают наиболее близкий профиль и оп-ределяют таксономическую принадлежность микроорганизмов, 1 з.н ф-лы, 2 ил.Изобретение относится к микробиологии, в частности для быстрой идентификации микроорганизмов в медицинской микробиологии и выявления промьпп 5 ленных загрязнений в биотехнологии.Цель изобретения - повьппение чувствительности и ускорение способа,Способ иллюстрируется следующими примерами. 0П р и м е р 1. К 3 мл суспензии клеток Е. со 11 Мс концентрацией 10 кг/мл, приготовленной на физиологическом растворе добавляют 0,3 мл раствора 4-метилумбеллиферилфосфата (0,1 мг/мл в диметилсульфоксиде) к трем другим аналогичным пробиркам добавляют раствор 4-метилумбеллиферилацетата, 4-метилумбеллиферилбултирата, 4-метилумбеллиферилпальмитата. 20 Исследуемые пробы помещают в водяную баню при 40 С на 15 мин, после. чегоОбыстро охлаждают до 4-5 С и фпуориметрируют. Длину волны возбуждений Флуориметра устанавливают на 320 щ, 25 члина волны Флуоресценции 450 нм, По полученным величинам Флуоресценции каждой пробы строят профиль исследуемой суспензии клеток, который сравнивают с предварительно получен- . 30 ными профилями, выбирают наиболее близкий к полученному и пелают вывод о таксонономической принадлежности клеток (Фиг. 1).П р и м е р 2, Суспензию клеток В. Ыптхпдепзз (концентрация 10 кл/мл), выращенную на МПА 17 ч и приготовленную на физиологическом растворе, разливают в трй пробирки по 3 мл в каждую. К первой добавляют 0,3 мл раствора 4-метилумбеллиферилфосфата (с концентрацией 01 мг/мл на дметилсульфоксиде), к второй 0,3 мл раствора флуоресцеиндиацетата (0,1 мг/мл на ацетоне), к третьей 0,3 мл раствора резазурина (0,1 мг/мл на дистиллированной воде), Получено ные смеси инкубируют 15 мин при 40 Со на водяной бане, охлаждают до 5-6 С и Флуориметрируют первый раствор 5 О ц, р 320 нм,Яф=450 нм, второй Лп = =470 нм, Лф =515 нм, третий раствор Л =520 нм, Я,=570 нм. Строят проФиль величин Флуоресценции, по которому судят о таксономической принадлежности исследуемой культуры клеток(Фиг, 2). Для простоты измерения мож" но испольэовать одну общую для всех красителей Я, возбуждения (ближний ультрафиолет), Использование фцуоресценции позволяет определять исключительно малые концентрации клеток, так как чувствительность может быть ирак- тически неограничено повьппена за счет увеличения интенсивности возбуждающе-. го фпуоресценции света (использование более мощных ламп, лазеров) и увелиучения времени инкубапии клеток с субстратомСпособ может найти применение вепрактике санитарно-бактериологическихлабораторий для быстрого и точногоопределения видовой принадлежностивь 1 росших на питательных средах микроорганизмов по полученным профилям,вчастности для определения малых количеств санитарно-значимых микроорганизмов в пробах воды, воздуха, продуктовили пробах, взятых с поверхностей.Используемые известные практике методы требуют затрат времени на определение от нескольких часов до нескольких суток. Использование предлагаемого способа, при сохранении надежности определения составляет 10-30 мин,Формула изобретения1, Способ определения таксономической принадлежности микроорганизмов путем инкубирования отдельных проб исследуемой суспензии с флуорогенными субстратами с последующим определением таксономической принадлежности микроорганизма по величине фпуоресценции, полученной в результате взаимодействия ферментов микроорганизмов с субстратом, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повьппения чувствительности и ускорения способа, в качестве Фпуорогенных субстратов используют вещества, расщепляемые внутриклеточными ферментами микроорганизмов.2. Способ но п. 1, о т л и ч аю щ и й с я тем, что в качестве флуорогенных субстратов используют 4-метилумбеллиферон, 4-метилумбеллиферилацетат, 4-метилумбеллиферилпирофосфат, 4-метилумбеллиферилсульфат, резазурин и/нли Фпуоресцеин.1440917 Составитель А.ЗавадскаяТехред М,Дидык тор М,Недолуженко ректор И,Муск Заказ 6141/ Тираж 520Государственного комитета СС елам изобретений и открытий сква, Ж, Раушская наб.,Подписно е НИИ 303 11 5, Мо д, 4/5еще юэводственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород, ул. Проектная,