Способ выделения аутопротромбина с

Союз СоветскихСоциалистическихРеспублик ОП ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ оа 890248(5) М. Кл. С 01 И 33/48 3 Ьеударстмнный квинтет СССР до двлаи нзворвтеннй н открытий;(д Тюменский государственный медицинский институт(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ АУТОПРОТРОМБИНА С . Изобретение относится к медицине,а именно к биохимическим способамвыделения факторов свертывания крови.Известен способ выделения аутопро 5тромбина С из крови, путем хроматографической очистки его Г 13,Однако известный способ требуетдля своего осуществления большогоколичества длительных и трудоемкихопераций, на выполнение которых требуется пять суток непрерывной работы.Целью изобретения является ускорение способа,Эта цель достигается тем, что приосуществлении способа выделения аутопротромбина С из крови путем хромато"графической очистки его, аутопротромбин С выделяют из сыворотки крови,при этом ее разбавляют 0,18-0,20 Мфосфатным буфером в соотношениисоответственно при рН 7,0, далее. еесмешивают с гелем ДЭАЭ -СефадексаА, предварительно набухшим в том же буферном растворе, далее промывают гель названным буферным раствором, и целевой продукт извлекают 0,40- 0,45 М фосфатным буфером при рН 8,1- 8,2.Способ осуществляют следующим образом.Аутопротромбин С извлекают непосредственно из разбавленной 0,2 М фосфатным буфером (рН 7,0) сыворотки крови с помощью ДЭАЭ-Сефадекса А, который затем помещают в колонку и освобождают от сопутствующих белков пропусканием фосфатного буфера (0,2 М, рН 7,0), вытесняя после этого аутопротромбин С фосфатным буфером с рН 8,2 (0,4 М), таким образом, извлечение аутопротромбина С производят непосредственно из отделяющейся при свертывании крови сыворотки.П р и м е р 1. 400 мл сыворотки крови, полученной при самопроизвольном свертывании крови при 37 С в течение 1 ч, разбавляют 1:4 0,2 М фос-.Фатным буфером с рН 7,0, К разбавленной сыворотке приливают набухший декантированный гель ДЭАЭ-Сефадекса А(12 г в 0,2 М фосфатном буфере с рН 7,0). Смесь экспонируют при комнатной температуре 0,5 ч при непрерывном помешивании. Затем смесь вносят в стеклянную колонку (30 х 900 мм), позволяя жидкости свободно стекать, После сформирования столба геля колонку промывают тем же буфером (700 мл). Затем через колонку пропускают са скоростью 20 капель в минуту 0,4 М фосфатный буфер с рН 8,2, собирая вытекающую жидкость порциями по 8 мл. Выход белка из колонки устанавливают по оптической плотности растворов при 280 нм. Фракции, содержащие белок, объединяют, охлаждают при 0 С, и удаляют выпавшие при этом кристаллы Фосфатов центрифугированием. Раствор белка разбавляют в 2 раза дистиллированной водой и вновь смешивают с гелем ДЭАЭ-Сефадекса А(12 г геля,набухшего в 0,2 М фосфатном буфере с рН 7,0). После экспозиции в течение 0,5 ч повторяют фракционирование на колонке. Белоксодержащие Фракции объединяют на колонке (Акрилекс П, 40 Х 300 мм), контролируя выход белка по оптической плотности при 280 нм, Фосфаты в полученных фракциях белка не обнаруживались. Полученный белок представляет собой аутопротромбин С, гомогенный по данным диск-электрофореза в присутствии додецилсульфата. При многократном применении способа выход гомогенного аутопротромбина С составляет 33-2,6 мг из 1 л сыворотки, В пробе "Частичное тромбопласти- . новое время плазмы" 0,03 мг аутопротромбина С сокращают время свертывания с 120-6,8 до 40,1-0,9 с.П р и м е р 2. Кровь, полученную из яремной вены быка, помещают на 1 ч при 37 С, Сыворотку отделяют центрифугированием в течение 20 мин при 1500 об/мин, 400 мл сыворотки разбавляют 1:40,2 М фосфатным буфером (рН 7,0). К разбавленной сыворотке приливают гель ДЭАЭ-Сефадекса А(12 г набухшего геля), смесь экспонируют 0,5 ч при комнатной температуре, непрерывно помешивая. Смесь вносят в стеклянную колонку (30 х 900 мм), позволяя стекать жидкости. После сформирования столба геля колонку промывают тем же буфером (700 мл), а затем пропускают через колонку 0,4 Мособ Известный редложенный спосо а Времж азвание оп звание опе- рации Адс ция проновогоса суль тромб комле фатом элюир цитра ни 6 Отсутствует том Освобождениеот ионов цитрата диализо 36 Отсутст Высаливаниесульфатомаммония иобессоливание с помощью ди- ализа 32 Отсутствуе Изоэлектрическое осаждениепротромбинового комплексаи его концентрация 55 Отсутствует 5 1 О 35 20 Фосфатный буфер с рН 8,2, собирая вытекающую жидкость порциями по 8 мл. Белоксодержащие фракции (порции элюата 30-36) объединяют и подвергают рехроматографии при тех же условиях, Белоксодержащие фракции (порции элюата 29-37) охлаждают при 0 С, выпавшие кристаллы фосфатов отделяют центрифугированием и хроматографируют на колонке с Акрилексом П(40- 300 мм). Собранный обессоленный белок (0,3 мг в 1 мл, общий объем 45 мл) подвергают проверке в тесте "Тромбопластиновое время плазмы" с частичным (неполным) тромбопластином, обнаружено укорочение времени свертывания с 120 до 4 1 с. Часть раствора концентрируют и подвергают дискэлектрофррезу в присутствии додецилсульфата. Исследуемый белок движется при электрофорезе в виде одной полосы, что свидетельствует. об однород- ностИ, т.е, чистоте продукта.Сравнительные данные, подтверждающие преимущества предложенного способа выделения аутопротромбина С, приведены в таблице.ф 890248 б Продолжение табл обходимого для выделения аутопротромбина С, в три раза.Предложенныйспособформула изобретенияВСпособ выделения аутопротромбинаНазвание опе- С из рови путем хроматографическойрации очистки его 1. о т л и ч а ю щ и Й с ятем, что, с целью ускорения способа,Известный способ Название операцииАктивация протромбиновогокомплекса иосвобождение от. взвеси тромбопластина Активация путем самопроизвольногосвертываниякрови Ионообменнаяхроматографияна ДЭАЭ-,целлувлозе Связывание фактора Ха с ионообменником ихроматографияна ДЭАЭСефавдексе А Обессоливаниеаутопротромбина С Обессоливание кутопротромбина С Составитель Ю.АлмазовРедактор О;Персиянцева Техред М, Надь Корректор Г,Огар е в авве вве Заказ 10960/71Тираж 910 Подписное ВНИИПИ Государственйого комитета СССР по делам изобретений. и открытий 13035 Москва Щ"35 Раушская наб. д.4/5 ъ 2 в - 2 8 Филиал ППП "Патент",г.ужгород, ул.Проектная,4Предложенный способ позволяет сократить число операций и времени,неаутопротромбин С выделяют из сыворотки крови, при этом ее разбавляют.0,180,20 М фосфатным буфером.в соотношении 1:4 соответственно при рН7,0, далее ее смешивают с гелемДЭАЭСефадекса А 50, предварительнонабухшим в том же буферном растворе3Фдалее промывают гель названным буферным раствором, и целевой продуктизвлекают 0,400,45 М Фосфатным буфером при рН 8,18,2,Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Стручкова С.М., Баскова И.П.,Сучкова С.Н. Влияние аутопротромбив;на С на процесс тромбиногенеза внормальной плазме и плазме, лишенной фактора ХП.Биохимия. 1969, 34,4, с,816-823