Способ получения митогенного фактора

Оп ИСАЙИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз Советск ихСоциалистическиеРеспублик и 889001(б) Дополнительное к авт. свнд-ву(22)Заявлено 03,01.80 (21)2908897=28-13с присоединением заявки РЙ(51)М. Кл. А 61 К 35/26 6 и 3 ааретееаЖ квиктет СССР до делэи изобретений и еткрытнй(5 З) УДК 61. .771.7(088.8) Дата опубликования описания 18, 12.81 Ы:. Ц 1 с. фф 7 й-п 1. С(71) Заявитель Белорусский научно-исследовательскийкрови 5 Й) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МИТОГЕННОГО ФАКТОРА Изобретение относится к медицине а именно к способам получения препаратов, стимулирующих иммунитет,Известен способ получения митогенного фактора путем инкубации культуры лимфоцитов человека с фитогемаг" глютинином с последующим отмыванием и культивированием лимфоцитов в.питательной среде Г 11Однако известный способ не обеспечивает стабильного получения митогенного Фактора с .достаточно высокой активностью, что не позволяет созда" вать на их основе метод получения.митогенного Фактора.Целью изобретения является повышение активности целевого продукта.Эта цель достигается тем, что при осуществлении способа получения митогенного Фактора путей инкубации культуры лимфоцитов человека с Фи" тогемагглютинином (ФГА) с последую,щим отмыванием и культивированием лимфоцитов в питательной среде, отмытые лимфоциты культивируют при 3940 вССпособ осуществляют следующим образом,Лимфоциты человека выделяют из гепаринизированной крови здоровых доноров в градиенте плотности фиколлгипаг, отмывают и ресуспендируют вконцентрации 3-4 млн/мл в бессывороточной среде Игла. Клети инкуби 10руют 40 мин с фитогемагглютинином(ФГА) и культивируют в течение 48 чпри 40 С в бессывороточной питательной среде. Затем клетки осаждают цент 15рифугированием и удаляют, а бесклеточную культуральную среду, содержащую митогенный фактор, собирают истерилизуют Фильтрованием через мембранные фильтры, сохраняют при 20 С.П р и м е р, Лимфоциты выделяютиз свежей донорской крови, стабилизированной гепарином, путем центриФугирования в градиенте плотностификолл-гипаг (плотность 1,077 г/см ),38890 дважды отмывают средой 199, Клетки доводят до концентрации 3,7 млн/мл в среде 199 и инкубируют с ФГА-Р (в концентрации 30 мкг/мл) при 37 С в течение 40 мин, Затем лимфоциты от 5 мывают от ФГА, не связывающегося с клетками, и культивируют в бессывороточной питательной среде Игла, содержащей глютамин - 100 мкг/;,л, пенициллин - 100 ЕД/мл и стрептомицин - 100 мкг/мл в течение 48 ч вотермостате при 40 С в атмосфере увлажненного воздуха с 53-ной С 011. В конце культивирования клетки удаляют иэ среды центрифугированием при 15 1000 об/мин, а культуральную среду, содержащую митогенный фактор, отсасывают и фильтруют через стерилизующие миллипоровые Фильтры (размер пор 0,3 мкм), Иитогенная активность культуральных сред исследуется в тест-культурах свежевыделенных лимфоцитов здоровых доноров, Для этого смешивают 1 объем исследуемой на активность культуральной среды в 3синтез ДНК (имп/мин) в тест-культусинтез ДНК имп мин в контрольныхфактораСравнительные результаты, полученные предложенным способом и известным способом, представлены в таблице Ф е Количество Температура культивирования Активность митогенногоФГА-стимулированных лимфа- фактора (выраженная вцитов индексах стимуляции) живых клетокв культуре,млн/мл 37 (известный способ)40 (предложенный способ)о 2,67 3,180,33 п=419,9+2,52п=4 250 0,82 3,271,22 Как видно из таблицы культивирование стимулированных ФГА лимфоцитов в соответствии с предложенным способом при 40 С приводит к увеличениюоактивностй получаемого митогенного фактора в 6,25 раза по сравнению с активностью фактора, полученного известным способом. Данные таблицы также обосновывают предел повышения температуры культивирования, так как культивирование при 42 С не вызываетоувеличения продукции митогенного фактора и приводит к гибели большей части клеток,014объема свежей питательной среды Игла с 10 термоинактивированной аутосыворотки в присутствии глютамина и антибиотиков в указанной концентрации. Конечная концентрация лимфоцитов в тест-культурах - 0,6 млн/мл.Для инактивации остатков ФГА в исследуемые культуральные среды прибавляют 6 кроличьей антисыворотки против ФГА. Синтез ДНК в тест-культурах исследуют по включении 3 Н-тимидина, радиоактивность клеток измеряют на спектрометре ПАКАРД 2450. Активность митогенного фактора выражают индексом стимуляции, который представляет собой отношение величины синтеза ДНК в тест-культурах в присутствии фактора к величине синтеза ДНК в контрольных тест-культурах, не содержащих митогенного фактора, но содержащих ФГА в концетрации 7,5 мкг/мл и 6 антисыворотки против ФГА (контроль на нейтрализацию ФГА), Таким образом, индекс стимуляции (ИС) рав- чяется рах с митогенным фактором тест-культурах без митогенного Способ применени.пользованем зо крови различных доноров (5 человек).В результате установлено, что кульотивирование лимфоцитов при 40 С приводит к стимуляции выделения фактора в 100 случаев, средний коэффициент усиления продукции равен 359,16. При использовании в качествежелаемой активности фактора индекса стимуляции 4 видно, что по известному способу Фактор с желаемой 40активностью получен в 2 случаях иэ 5(405), а по предложенному способу в1003 случаев. Таким образом, предложенный способ позволяет повысить активность целевого продукта при уменьшении затрат крови доноров, идущей 45для получения митогенного фактора.889001 Формула изобретения Составитель Ю. АлмазовРедактор Л. Плисак Техред Е.Харитончик Корректор С, Щомак Тираж 690 Подписное ВНИИПИ. Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035 Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5Заказ 10801/9 филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная,Способ получения митогенного фактора путем инкубации культуры лимфоцитов человека с фитогемагглютинином с последующим отмыванием и культивированием лимфоцитов в питательной среде, о т л и ч а ю щ и й с я тем,что, с целью повышения активностицелевого продукта, отмытые лимфоцитыкультивируют при 39-40 С.5Источники информацииФпринятые во внимание при экспертизе1. Авторское свидетельство СССРпо заявке М 2628368/28-13,кл. А 61 К 35/36, 1978.