Способ диагностики ларвальногоаскаридоза

Союз Советских Социалистических РеспубеаОП ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(22) Заявлено 28.05.79 (21) 2771043/28-13 Р 1)М Кф с присоедииеииею заявки йо -А 61 В 10/00 Госудерствеииый комитет СССР ио ямам:. изобретений и открытий(088.8) Дата опубликования описания 26. 03. 81 еН.В. Чебышев, М.Ш. Вербицкий, М.В. Далин, АТ. Михайлови О.Г. Полетаева(72) Авторы изобретению ПеРвый Московский ордена Ленина и орд Трудового Красного Знамени медицинскиинститут им. И.М.Сеченова на : 1 у."(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ЛАРВАЛЬНОО ЫИ"и;АСКАРИДОЗА Изобретение относится к медицине, а именно гельминтологии и предназначено для дйагности ранних стадий аскаридоза.Известен способ диагностики лаврального аскаридоза с помощью специфической реакции микропреципитации на живых личинках аскарид в возрасте 7 сут, 13Однако выход личинок 7 сут. развития от зараженных животных подвержен большим индивидуальным колебаниям,.что затрудняет массовую постановку теста.Известен также способ ларвального аскаридоза путем проведения реакции между испытуемой сывороткой и сенсибилизированными антигеном эритроцитами с последующим учетом результатов их взаимодействия 2.Однако известный способ недостаточно специфичен.Цель изобретения - повышение специфичности.Поставленная цель достигается тем, что реакцию проводят с эритроцитами сенсибилизированными личиночным антигеном с молекулярным весом 8000-12000, выделенным из полостной жидкости взрослых аскарид и при положительной реакции в титре 160 и выше диагностируют аскаридоз.Способ осуществляют следующимобразом,Сначала получают специфическийличиночный антиген аскарид из полостной жидкости аскариды ПЖА).Для этого 120 мл ПЖА фильтруют0 через милнпоровый фильтр. Фильтрацию ПЖА осуществляют черезмембрану с размерами пор 140-145 А.В ячейку заливают 90,5 мл ПЖА,плотность 0=3,750, рН=4,95-5,0,15 выпускают 74 мл диализата 1,О=4,650, рН=5,0., добавляют 32 млдистиллированной воды и начинают1-ю промывку. Ч34 мл; О = 1,360 рРН - 5,0520 Добавляют 15 мл дистиллированнойводы и начинают 2-ю,промывку:Ч 15 мп, О = 0,860, РН = 5,0,снова добавляют 15 мл воды и на"чинают 3-ю промывку: Ч и 19 мл;О =. 0,360, РН = 5,2, добавляют20 мл дистиллированной воды и начинают 5-ю промывку: Ч щ 20 мл;О = 0,045, рН = 5,0. Диализат 1и промывки объединяют Ч = 180 мл 130 О = 1,530 рН = 5,05.Диализат стерилизуют через милипоровый Фильтр (диалиэат 1) Концентрат 1, полученный при фильтрациичерез мембрану с размером пор 140145 А имеет объем 4,5 мл, О = 1,950,рН =, 5,05. Затем осуществляют фильтрацию диалиэата 1 через мембрану сразмером пор 17-18 А. Для этогов маленькую ячейку заливают 180 млдиализата 1. Выпускают 169 мл,О = 0,610, рН = 4,0, собирают концентрат П, Ч = 11 мл, О - 14 р 10рН = 3,85.К концентрату П Ч = 11 мл добавляют 22 мл дистиллированной воды и полученный раствор заливают в ячейкумембраны. 1 промывка Ч = 22 мл,О = 0,340, рН=3,9.Добавляют 22 млдистиллированной воды и начинают .2-ю промывку, Ч = 25 мл, О = 0,270,рН = 4,0, собирают концентрат П ипромывают.Проводят повторную коррекцию рНдо 5,75-5,9, Ч = 212 мл, О = 0,550,рН = 5,90 (диализат П), Фильтруютчерез мембрану с размером пор 9-10 АВ большую ячейку заливают 212 млдиализата П. Выпускают 140 мл диализата, О = 0,345, рН = 5,05, концентрат с Ч = 72 мл переносят на маленькую ячейку мембраны с размером пор9-10 А. Продолжают концентрирование.Выпускают 65 мл диалиэата, О0,470, рН = 5,0. Собирают концентрат Ш: Ч = 7,5 мл, О = 2,850, который стерилизуют через милипоровыйФильтр. Доводят. рН концентратадо 7,2-8,6Определяют специфичностьантигена в реакциях иммунодиффузии,иммуноэлектрофорезах и РНГА.Личиночный антиген имеет молекулярную массу 8000-12000 при электрофорезе в 0,1 М трис-ЭДТА-боратномбуфере мигрирует к аноду со скоростью соответствующей подвижностиФракции Ы, - )Ъ -глобулинов сывороткикрови человека при градиенте напряжения 5 В/см, в реакции иммунодиффуэии и иммуноэлектрофореза сгипериммунной сывороткой кроликов, зараженных генвазионными яйцами аскариды, формирует полосу преципитации соответствующего протективному специфическому личиночному антигену личинокаскариды 7 сут, развития. Диагностику ларвального аскаридоза с использованием полученного специфического личиночного антигена аскариды осущестьляют следующим образом.П р и м е р. КонсервированныеФормалином эритроциты отмывают трираза забуференным Физиологическимраствором, рН 7,2 при 2000 об/минв течение 3-5 мин,Состав буфера, мл:0,15 М йаНР 04 720 15 М КНР 04 280,9 НаСВ 900 Затем к 2,5 Ъ суспензии эритроцитов вливают 1:1 раствор танина вбуфере (1:20000 ) и полученную смесьинкубируют в термостате при 37 оС втечение 30 мин..После этого эритроциты отмываюттри раза забуференным физилогическим раствором, рН = 7,2 при2000 об/мин в течение 3-5 мин и ресуспендируют в буфере до 2,5 суспензии.Меофилизированный порошок специфического личиночного антигена аскариды растворяют в буфере при рН=7,2до концентрации белка 2 мг/мп,Танизированные эритроциты соеди 15 няют с равным объемом антигена и полученную смесь оставляют в термостате на 3 ч при 370 С. Затем эритроциты, сенсибилизированные антигеном(диагностинум) отмывают 3 раза, ре 2 О суспендируют для получения 1,5суспензии, консервируют мертиолатом (1:10000 конечная концентрация)и оставляют в холодильнике до следующего дня.Все сыворотки (испытуемые, положительная контрольная сыворотка инормальная кроличья, на которой ставят реакцию, то есть разводящая) инактивируют, длячего прогревают вводяной бане при 56 С в течение30 мин. После инактивации сывороткиадсорбируют: к 1 мл сыворотки добавляют 0,2 мл отмытых консервированныхэритроцитов и выдерживают не менее2-х ч, перед постановкой реакцииЗ 5 нормальную кроличью сыворотку разводят 1:100 забуференным физиологическим раствором и на ней готовятпоследовательно двукратные разведения испытуемых сывороток и конт 40 рольной положительной, начиная с1:20 и кончая 1:1280 (7 разведений).Реакцию ставят в агглютинационныхдосках.Для испытания сыворотки диагностикумом (специфическим очищенным личиночным антигеном аскариды) готовят 2 ряда последовательных дву кратных разведений (по 0,25 мл в каж.дой лунке).В первый ряд закапываютдиагностикум по 1 капле в каждоеразведение сыворотки, а во второйряд закапывают по 1 капле таниэированных зритроцитов (1:,5суспензия - контроль сыворотки)В качестве контроля диагностикума прово 55 дят аналогичное его испытание с заведомо положительной сывороткой зараженного аскаридами кролика,. взятойна пике актителообразования (20-30дни развития генвазии), а также сщ 0 разводящей сывороткой (2-3 лунки).Реакцию в зависимости от ее интенсивности оценивают по четырехплюсовой системе:- компактный клеточный агре 65 гат,814339 формула изобретения Составитель С. МалютинаРедакто Т. Киселева Тех ед Л.Савка Корректо Г. Наза ова Заказ 863/3 Тираж 687 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035 Москва ЖРа сная наб., д. илиад ППП Патент , г. Ужгород, ул. Проектная, 4- ровный слой клеток со складчатыми краями на дне лунки,- ровный слой клеток, краяместами зазубренные,+ - слой клеток окружает темноеузкое кольцо, плотный круглый осадок клеток в центрелунки "пуговкаф.За положительный результат принимают положительную реакцию не менеечем на три креста с разведением сыворотки 1:160, принятым за диагностический.,Предлагаемый способ позволяет повысить специфичность иммунодиагностической реакции на ларвальный аскаридоз и открывает воэможность проведения широких клинических и ветеринарных исследований по выявлениюданнсго заболевания. Способ диагностики ларвального аскаридоэа путем проведения реакциимежду испытуемой сывороткой и сенсибилизированнымн антигеном эритроцитами с последующим учетом результатов их взаимодействия, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с целью5 повышения специфичности, реакцию проводят с эритроцитами сенсибилизированными личиночным антигеном с молекулярным весом 8000-12000, выделенным из полостной жидкости взрослыхо аскарид и при положительной реакции в титре 160 и выше диагносцируют аскаридоэ.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Лейкина Е.С. Изучение ин витро5 антител, вырабатываемых у белых мышей. ас 1 нЬг.-"Медицинская паразитологчя и параэитные болезни", 1947т. 16, Р 4.2. Полетаева О.Г,дЗаточкина Э.Г.20 Применение реакции РНГА для определения длительности сезона зараженияв очаге аскаридоза.-"Медицинскаяпаразитология.и паразитыые болезни",1974, Р 3, с. 273-278.