Способ получения протеинов из яичного белка

ОП ИСАНИЕИЗОБРЕТЕН ИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз СоветскихСоциалистическихРеспублик 11, 745478ло делам изобретений н отнрытнй(088.8) Опубликовано 07,07,80 Бюллетень25 Дата опубликования описания 07,07.801Изобретение относится к комплексному получению протеинов из яичного белка, напримерлизоцима, овальбумина, овоглобулина, используемых как сырье для получения аминокислотв медицине, косметике, микробиологическойи пищевой промышленности,Известен способ получения протеинов иэяичного белка путем последовательного осаждения содержащихся в нем фракций лнзоцима,овоглобулина, овальбумнна с последующей ихочисткой кристаллизацией (11.Однако недостатками известного способаявляются низкая активность препарата лизоцима,недостаточная чистота овоглобулина и овальбумина, сложность и длительность процесса, связанная с многократностью перекристаллиэацией15и стадий очистки,Целью изобретейия является повышение активности препарата лизоцима, чистоты овоглобулина и овальбумина, упрощение процесса получения протеинов и обеспечение высокого их вы.хода.Поставленная цель достигается тем, что перед осаждением фракций яичный белок вьщер 2живают прн рН 4,8 - 5,3, температуре 17 - 22в течение 48 - 72 ч, и отделяют выделившийсяпобочный белок - овомуцин, а последовательное осаждение фракций осуществляют из раствора, отделенного от осажденного овомуцина,Предлагаемый способ обеспечивает активностьлизоцима 25000 - 30000 ед/мг белка, чистоту овоглобулина - 100%, чистота овальбумина - 100%,с высокими выходами и упрощение процесса.Увеличение активности лизоцима достигает.ся за счет того, что в процессе вьщерживанияяичного белка при рН 4,8 - 5,3 и температуре17-22 С в течение 48-72 ч происходит,актива.ция исходного сырья, что приводит в итоге кразложению фермент-белкового комплекса иосвобождения лиэоцима,.В исходном сырье лизоцим связан с другими белками, что ведет к обратимой потере егоактивности. В процессе вьщерживания исходногосырья происходит освобождение фермента отбелка. Кислая среда рН 4,8 - 5,3 разрушает связьлизоцима с другими белками. Тем самым создаются условия для восстановления. активностилизоцима,745478 3В процессе выдерживания яичного белка происходит освобождение активного центра ли зоцнма, который в исходном сырье частично блокирован неактивной: частью фермента, так как фермент находится в виде агрегатов друг с другом.Предлагаемое изобретение обеспечивает так. же получение овоглобулина и овальбумнна высокой чистоты вследствие того, что в процессе активации сырья происходит осаждение побочных белков, включая овомуцин. Переход овомуцина в твердую фазу способствует его удалению, Дальнейшему фракционированию подвергают жидкую фазу, не содержащую примесей побочных белков, что повышает чистоту выделяемых протеинов.Осаждение овомуцинов в процессе активации сырья одновременно обеспечивает упрощение процесса очистки, т,е. за счет сокращения количества перекристаллиэаций овоглобулина и овальбумина с 5-ти до 2-х раз и количество перекристаллизаций лизоцима с 3-х до 2-х раэ,П р и м е р 1, К 60 л яичного белка при перемешивании добавляют 1 н раствор соляной кислоты до значения рН 5,0.Смесь оставляют при 20 С. Осаждается слизистый осадок, состоящий в основном из овомуцина, Кристаллизация лиэоцнМа.Через 72 ч осадок удаляют декантацией, а к жидкости при перемешивании добавляют МаС до получения 5%-ного раствора и раствор едкого натрия до рН 9,5. Перемешивание продолжают до полного растворения соли, К при готовленному раствору для кристаллизации лизоцима прибавляют 10 - 25 мл суспензии кри. сталлов лизоцима и оставляют при 5 С,Раствор каждый день 2 - 3 раза перемешивают. Кристаллизация лизоцима заканчивается . в течение 6 сут. Кристаллы лизоцима собирают центрнфугированием и перекристаллизовывают, а центрифугат используют для получений овоглобулина и овальбумина.Осадок технического лизоцима растворяют в 3 л 0,05 раствора уксусной кислоты, нерастворившийся осадок отделяют центрифугированием и еще раз растворяют в 1 л 0,05 растворе уксусной кислоты и опять центрифугируют. Осадок отбрасывают, а центрифугаты объединяют. К центрифугатам добавляют натрий хлористый из расчета, чтобы получить 5%.ный раст. вор и 1 н раствор едкого натрия до рН 9,5. Раствор оставляют при 5 С и в течение 3 сут заканчивается перекристаллизация, Вьшавший осадок перекристаллнзовывают еще 1 раз как описано. Сырой осадок лизоцима после второй перекристаллизации собирают на путч-фильтре и высушивают лиофильно. Активность лизоци. ма 30 000 ед/мг, выход - 150 г. Затем к раствору яичного белка (объем около 60 л) 4после отделения лизоцима при перемешиванви постепенно добавляюТ насыщенный раствор сульфата аммония в соотношении 1:1,06. Образуется осадок, состоящий из овоглобулина. Суспензию оставляют при комнатной температуре на 24 ч. Осадок собирают центрифутированием и подвергают дальнейшей очистке для получения овоглобулнна, а центрифугат используют для получения овальбумина, Осадок технического овоглобулина растворяют в 2,0 л деминерализованной воды, К раствору добавляют при перемешивании 2,0 л насыщенного раствора суль.фата аммония для переосаждения овоглобулина.Суспенэию оставляют при комнатной температуре и через 6 - 12 ч центрифугируют. Полученныйпродукт растворяют и осаждают подобным жеобразом еще 2 раза, После трехкратного осаждения осадки овоглобулина растворяют в минимальном количестве воды, диализируют черезцеллофан против деминералнэованной воды72 - 96 ч. Во время диализа образуется осадоковоглобулин, который собирают центрифугированием. Осадок растворяют в минимальном ко.личестве 5%-ного раствора сульфата аммония,Выход - 60 г овоглобулина. Чистота - 100%по хроматографическим данным. К центрифугату после отделения овоглобулнна при переме.шивании добавляют насыщенный раствор суль.фата аммония до тех пор, пока раствор не3 о приобретает устойчивое помутнение. В этот момент прибавляют 0,2 н раствор серной кислотыдо рН 5,1. Суспенэию оставляют при 20 С.Кристаллизация овальбумина завершается в те.челне 24 - 48 ч, Кристаллы овальбумина собирают центрифугированием, Жидкость отбрасывают, а осадок перекристаллизовывают. Крис.таллы овальбумина растворяют в 5 л деминерализованной воды. К раствору добавляют на.сыщенный раствор сульфата аммония (4;5 +4 О 0,5 л) до тех пор, пока жидкость не приобретет интенсивную и устойчивую опалесценцию,в раствор вносят кристаллическую затравкуи оставляют при 20 С, Через 48 ч кристалли.зацня заканчивается. Полученный продукт пе.45 рекристаллизовывают таким же образом ещераэ, После перекрнсталлизации овальбумин,растворяют в минимальном количестве водыи подвергают диализу через целлофан до отсутствия сульфата аммония, Обессоленный растворовальбумина высушивают лиофильно. Выход -650 г овальбумина. Чистота - 100% по хроматографическим данным,П р и м е р 2, 60 л яичного белка вливаютв стеклянный реактор. Активность лизоцима в исходном сырье 22000 ед/мл, К белку при пе ремешивании механической мешалкой медленно добавляют 1 н раствор соляной кислоты дорН 5,3, .Смесь оставляют при 22 С на 48 ч,В течение указанного времени активность лизоЗаказ 4036/1 Тираж 569 ПодписноеЦНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Филиал ППП "Патент", г, Ужгород, ул. Проектная, 4 5 74547дима в яичном белке повышается до 48000 ед/мли одновременно осаждаются побочные белки.Осадок удаляют декантацией, а жидкую фазуиспользуют для получения лиэоцима, овоглобулина и овальбумина, как описано в предыдущемпримере, Выход лизоцима 155 г, Активность лизоцима 26400 ед/мг белка, Выход овоглобулина - 62 г,Содержание основного вещества - 100%.Выход овальбумина 700 г, ,1 ОЧистота препарата - хроматографически чис,тый,П р и м е р 3. До обработки яичного бел.,ка определяют активность лизоцима, котораясоответствует 23500 ед/мл, 5К 70 л яичного белка при леремешиваниимеханической мешалкой добавляют 1 н растворсоляной кислоты до рН 4,8 и смесь оставляютпри 18 С. Через несколько часов яичный белокмутнеет за счет осаждения побочных белков.Через 72 ч осадок удаляют декантацией иотбрасывают, в жидкой фазе определяют активность лизоцима, которая равна 46500 ед/мл,Обработанный яичный белок при рН 4,8 ио18 С в течение 72 ч используют в качествесырья для получения лизоцима, овоглобулинаи овальбумина по способу, изложенному в примере 1. Выход лизоцима 170 г или 75% оттеоретического содержания. Активность лизоци.ма 28000 ед/мг белка,Выход овоглобулина 65 г.Чистота овоглобулина - хроматографическичистый.Выход овальбумина 800 г или 60% от теоретического содержания. 6Чистота овальбумина - содержание основного вещества 100% по хроматографическим дан-ным,Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить качество биохимпрепаратов: ли. зоцима, овоглобулина, овальбумина.Активация сырья и отделение побочных бел. ков обеспечивают увеличение активности лизоцима в 1,5 - 2 раза, повышение чистоты овоглобулина с 95 - 97% до 100% чистоты овальбумина с 95 - 98% до 100%,Формула изобретении Способ получения протеинов иэ яичного бел.ка путем последовательного осаждения содержащихся в нем фракций лизоцима, овоглобулина,овальбумииа с последующей их очисткой кристаллизацией, о т л и ч а ю щ и й с я тем,что, с целью повышения выхода указанныхфракций, упрощения способа, урвышения актив.ности лизоцима и чистоты овоглобулина и оваль.бумина, перед осаждением фракций яичный бе.лок выдерживают при рН 4,8 - 5,3, температуре17 - 22 в течение 48 - 72 ч и отделяют выделившийся побочный белок - овомуцин, а последовательное осаждение фракций осуществля.ют иэ раствора, отделенного от осажденногоовомуцина,Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Авторское свидетельство СССР Н 247703,кл. А 23 .1 1/08, 1968.