Способ получения азотсодержащих полисахаридов, обладающих противоопухолевым действием

Союз Советскик Социалистических Республик)М. Кл 2 З) Приоритет 3 80664/76 1 К 35-66 07,07.7Япония Государственный комн СССР по дедам нэобретеин н открытийУДК 615 4561 .396,11(088,8 Опубликовано 25.0 4.8 Дата опубликования юллетень М 15 исания 28.04.80 ИностранцыЧикао Есикуми, Фуми ада, Такаеси Фудзии(Япония)транная фи Когио Кабу(Япония) иросе, Есио Омура,йичи Такахаси рмасики К Иносагаку 1 Заявитель Курех ПОСОБ ПОЛУЧ ОБЛАДАЮЩИХ Изобретение относится к химико- фармацевтической промышленности и касается получения лекарственных пре паратов.Известен способ получения азотсодержащих полисахаридов, обладающих противоопухолевым действием, путем экстракции из грибов класса базидиомицетов горячим экстрагентом с по следующим выделением и очисткой целевого продукта (1). выходен - 3тся повукта,о экстцв рептв оромн, иацией л,.ы ю аквщел о ов, относящихРо 1 урогасеае,1 ог (Рг) Яце 1, аствора щелочи роокиси натрия сщем грибы в б л) Авторы ИЗОбрЕтЕНИя Сабуро уэ ТосихикОднако при этом способ евого продукта незначите Целью изобретения явля ение выхода целевого прод Это достигается тем, ч ию ведут из грибов Сог 1 о Е Ро 1 урогасеае водным ра очи в концентрации 0,01 чистку ведут ультрафильт братимым осмосом, Кроме того, из грибся к Сог 1 о 1 цв депцз оберут Сог 1 о 1 ц з Чег з асса в качестве водного риспользуют раствор гидв количестве превьп 13 зл5-200 раз (по весу). ИЯ АЗОТСОДЕРЖАЩИХ ПОЛИСАХАРИДОВПРОТИВООПУХОЛЕВЬК ДЕЙСТВИЕМ Ультрафильтрацию ведут под давлением 0,5-5 кг/см , а обратимый осмоспо давлением 25-35 кг/смф,Способ осуществляют следующим образом.Проводят экстракцию грибов изкласса базидиомицетов Сог 1 о 1 цв депцзоЙ Ро 1 урогасеае водным раствором щелочи в концентрации 0,01-2 Н. Притемпературе 50-110 оС, предпочтительно 80-98 ОС, в течение 20-600 мин.Для получения щелочного раствораприменяют различные щелочные соединения такие, как гидроокись натрия,гидроокись калия, гидроокись аммонияили кальция, предпочтительно применение гидроокисей калия и натрия.Полученный жидкий экстракт нейтрализуют обычным методом, применяя минеральную кислоту, например разбавленную соляную кислоту, и затем подвергают этот нейтрализованный экстрактультрафильтрации или обратимому осмосу, чтобы получить низкомолекулярныевещества (с мол.вес. менее 5000) вэкстракте. Для этого компоненты продукта фракционируют под давлением помолекулярному весу с применением мемраны, представляющей собой тип моекулярного сита.Процесс ультрафильтрации осуществляют под давлением О, 5-5 кг/смф,предпочтительно 1-4 кг/смф, и притемпературе 5-70 ОС,В случае применения обратимого осмоса, применяют давление порядка 2035 кг/смф, предпочтительно 2025 кг/смф, при температуре 5-20 С.Ультрафильтрацию применяют дляфракционирования материала с молекулярным весом свыше 10000 , а обратимый осмос применим для фракционирования материала с молекулярным весомменее 1000,Экстракт, из которого удаляют вещества с низким молекулярным весом(менее 5000), подвергают распылительной сушке или лиофилизации и затемпереводят в товарные продукты.Полученные полисахариды имеюткрасновато-коричневый цвет и содержат азот в количестве 2-8, в рядеслучаев 3-6 Они не имеют четкойточки плавления и постепенно темнеюти разлагаются при температуре выше1 2 00 С.Полисахариды растворимы в воде,почти нерастворимы в спирте, пиридине, хлороформе, бенэоле и гексане,не имеют вкуса и запаха.Молекулярный вес полисахаридов составляет 10000-100000.Азотсодержащие полисахариды обладают высокой противосВухолевой активностью с высоким коэффициентом задержания против саркомына мышах привнутрибрюшинном введении, но такжеобеспечивают эффективность леченияи при оральном применении.Полученные аэотсодержащие полисахариды могут быть использованы дляпредупреждения побочного действия вхемотерапии рака или повышения эффективности радиотерапии и предупреждаютинфекционные заболевания, вызываемыевирусами или бактериями, улучшаютфункцию печени, аппетит, регулируютвнутренние нарушения.и поддержаниеурологических функций.П р и м е р 1. К 200 г сухого мицелия Сог 1 о 1 из Чегз 1 со 1 ок (Рг) Яце 1(РЕВИ - Р Р 2414) прибавляют 4 л0,1 н, раствора БаОН и экстрагируютпри перемешивании на кипящей воднойбане при температуре экстрагируемоймассы 90-55 С в течение 1 час и затем охлаждают до 50 еС и порциями прибавляют 1 Н. раствора. НСР для под.держания рН 7,0. Затем удаляют твердую Фазу фильтрацией под;разрежениеми полученный твердый продукт промывают 500 мл воды, получая 4,2 л жидкого экстракта. Этот жидкий экстрактподвергают ультрафильтрации с применением специального ультрафильтрапри перемешивании и охлаждении, про-водя Фильтрацию под давлением1,5 кг/см при 10 С с отделением низкомолекулярных соединений с молекулярным весом менее 5000 и последующим концентрированием, получая 300 млраствора, который затем подвергаютлиофилизации и выделяют 26,6 г красновато-коричневого порошка (выход13,5). Этот порошок содержит 7,5влаги и имеет следующий элементныйанализ: С - 40,5, Н - 6,2,М - 5,8,О - 47,5 (процентное содержаниекислорода определяют, вычитая иэ 100суммарное процентное содержание ос 0 тальных элементов). Это вещество легко растворяется в воде и обладаетпримерно 90-,ым задерживающим коэффициентом против твердой опухоли саркомау мышей при внутрибрюшиином15 введении и 65-,ым при оральном применении.Антиопухолевый эффект соединенийопределяют обычным методом. Клеткиопухоли саркомытрансплантируют20 в брюшную полость мыши и после того,как эти клетки разрастутся в достаточной степени в течение 7 дней, 10таких. клеток трансплантируют под кожу подмышкой другой мыши, где обра 25 зуется твердая опухоль,Лечение препаратом, который испытывают, начинают через 24 часа послетрансплантации. В случае лечения интраперитонально препарат вводят в дозе 10 мг/кг за курс лечения один разв день, либо каждый второй день в течение 20 дней общей дозой 0,2 мл/20 гживого веса мыши, а в случае перорального применения препарат вводятдозой 1000 мг/кг за курс лечения,т.е. один раз в день в течение 20дней общей дозой 0,2 мл/20 г живоговеса мыши, В опухоли образуется ядрона 25-ый день после трансплантации,коэффициент задерживания роста опу 40 холи вычисляют из среднего веса опухоли мыши, которую лечат препаратом,и среднего веса опухоли контрольноймыши. Для сравнения экстракцию иочистку производят при тех же условиях, но применяя воду вместо 4 л0,1 н. раствора ИаОН, Выход продуктасоставляет 7,8 или около 60 от выхода, получаемого согласно способуизобретения.П р и м е р 2. К 500 г живогомицелия Сог 1 о 1 цз чегз 1 со 1 ог (Гг)Яце 1 РЕВИ - Р М 2414 (содержаниевлаги 70,8, общее содержание азота,2,6 в расчете на сухой материал)прибавляют 2 и воды и измельчают всмесителе для сока 10-20 мин. и кэтой смеси затем постепенно прибавляют 500 мл 1 н. раствора НаОН иэкстрагируют 2 часа на горячей водяной бане при температуре экстраги 60 руемой массы 90-95 С, затем нейтрализуют соляной кислотой, промывают иобрабатывают как описано в примере 1 .Полученный экстракт подвергают ультрафильтрации на специальном ультра 5 Фильтре для отделения низкомолекуляр730277 Формула изобретения 30 1. Способ получения азотсодержащих полисахаридов обладающих противоопухолевым действием, путем экстракции из грибов класса баэидиомице-тов горячим экстрагентом с последующим выделением и очисткой целевого продукта, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, экстракцию ведут из грибов Сог 1 о 1 цз депцз ой Ро 1 урогасеае водным раствором щелочи в концентрации 0,01 - 2 М, и очистку ведут ультрафильтрацией и/или обратимым осмосом.2, Способ по п. 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что из грибов, относящихся к Сог 1 о 1 цв депцз ой Ро 1 урогасеае берут Сог 1 о 1 цз чегв 1 со 1 ог (Гг) Яце 1,3. Способ по п. 1, е т л и ч а ющ и й с я тем, что в качестве водного раствора щелочи используют раст 35 40 45 50 вор гидроокиси натрия в количестве в 5-200 раз превышающем грибы (повесу) .4. Способ по и. 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что ультрафильтрацию ведут под давлением 0,5-5 кг/смга обратимый осмос 25-35 кг/смс.Источники информации,60 принятые во внимание при экспертизе1. Заявка Японии 9 50-34089,кл, ЗОА, 32, опублик. 1975. Тираж 673 Подписное Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 ных веществ с молекулярным весом менее 5000, затем концентрируют раствор и высушивают вымораживанием, получая 24,2 г коричневато-красногопорсяака (выход 15,1). Этот порошоксодержит 7,6 влагии общее содержание азота составляет 6,0, при раст- ф ворении в воде примерно 20 продукта не растворяется, Остальная часть хорошо растворима в воде, Данные элементного анализа С - 41,2; Н - 6,1;Б - 6,0 О - 46,7 (процентное содержание кислорода вычисляют, какразницу между 100 и суммарного процентного содержания остальных элементов). Этот порошок растворяют и, удалив нерастворяемую в воде часть припомощи фильтровальной бумаги,"проводят его задерживающее действие по отношению к твердой опухоли саркомау мышей. Установлен коэффициент задерживания в случае внутрибрюшинного введения примерно 93 в случае орального 70.П р и м е р 3. К 2 кг сухих ячеек Сог 1 о 1 цз чегз 1 со 1 ог (Гг) це 1 РЕВИ-Р Р 2414 (содержание влаги 8,0 общее содержание азота 2,5) прибавляют 20 л 0,4 н. раствора БаОН и подвергают смесь двухчасовой экстракции при перемешивании в экстракторе типа котла, снабженного рубашкой для обогрева и охлаждения н мешалкой, причем температуру в рубашке поддерживают такой, чтобы в экстрагируемой массе температура составляла 90-95 ОС. Проэкстрагированную суспензию охлаждают до комнатной температуры и порциями прибавляют 2 н. раствора НС 1 при перемешивании до создания, рН среды 7,0, после чего остаток (твердую Фазу) отделяют от жидкого экстракта в сепараторе типа центрифуги. Остаток (твердую фазу) смешивают с 20 л 0,4 н. раствора МаОН и подвергают подобной же экстракционной обработке в течение 2 час. при 90-95 вС, затем охлаждают, нейтрализуют и отделяют на центрифуге, получая жидкий экстр ак т и ос т ат ок .Остаток снова подвергают той же экстракционной обработке 0,4 н. раствора ВаОН в течение 1 часа, получая экстракт. Экстракцию повторяют 3 раза, получая всего 50 л жидкого экстракта, Этот жидкий экстракт концентрируют до объема около 10 л на ва-куум-концентраторе и затем подвергают на ультрафильтре с мембраной НРАфирмы АЬсог Ьпс при 10 ОС и под давлением 2,1 атм, отделяя ниэкомолекулярные вещества с молукулярным весом менее 5000, затем концентрируют обрабатываемый раствор до объема около 5 л. Также около 70 л обрабатываемого раствора, содержаЦИНИПИ Заказ 1335/56 5 10 15 20 25 щего низкомолекулярные Фракции, выгруженные из ультрафильтра, подвергают обратимому сомосу, удаляя низкомолекулярные фракции, и затем концентрируют до объема, около 5 л отрабатываемого раствора.Условия, проведения этой обработки: среднее давление 25-30 кг/смв темопература обработки около 10 С. Затем растворы, полученные после ультра- Фильтрации и после обработки методом обратимого осмоса, объединяют и 10 л такого объединенного раствора подвергают распылительной сушке, получая 395 г порошка красно-коричневого цвета (выход .19,9). Порошок содержит 7,0 влаги, данные элементарного анализа: С - 40,8; Н - 6,01 М - 4,0;О - 49,2. Коэффициент задерживания этого продукта по отношению к твердой опухоли у медей саркомасоставляет 92 в случае внутрибрюшинного введения и 70-в случае орального применения. Порошок хорошо растворим в воде.Предлагаемый способ обеспечивает высокий выход целевого продукта - 19,9 по сравнению с известным способом - 3,5