Способ определения свободного связанного холестерина в биологических жидкостях

(31) Р 2224132,3 Государственный комит Ф СССР ло делам изобретени и открытий) Заявлтел Иностранная фирма Берингер Маннхайм ГмбХ(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СВОБОД И СВЯЗАННОГО ХОЛЕСТЕРИНА В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ О Определяют холестерин в таких водных средах как э 1 стр 2 кты продуктов пптанп 1 екидкости, н 2 пример сыворотках.Предлагаемым способом определяют как свободныи, так и связанный холестерин, которьш находится в этерифицпрованной форме, Связанный холестерин может оыть определен после предварительного химического или ферментативпого омыления, Химическое омыление производят, например, под действием спиртового раствор:; гидраокиси калия, а ферментатпвное омы. ление производят эстеразой, преию.щественно холестерпноэстеразой, полученной из печени или поджелудочной железы.Измерение потребления кислорода, количества образовавшихся перекиси водорода или холестенопа может быть произведено с помощью обычных методов.Подходящими способами для определе - пя потрсблеЕшя кислорода являются, нап 1 зимср, газовая хроматография и деполяризацпонпый способ. Предпочтительнее всего пр 1 вЕенять способ поляриметрического определения с помощью кислородного электрода, поскольку этот способ особенно пригоден для автоматического определения холестсрппа.Образующуюся перекись водорода можно определять как тптрометрически, так и медицине г тя диагностида других заОднако извесает высокой спеедел ения.Целью изобрепецифичности и Эта пель дофермент холесвободный холщенного кислокиси водородававшегося холстерин предвабодную формулочного гидро стигаетстерни-оестеринрода ил, или пестенонрительнпутемлиза. Изооретение относится кможет быть использовано д,ки сердечно-сосудистых и ряболеваний.Известен способ определения холестерпна, основанный на выдерживании свободного холестерина (связанный этерифицированный холестерин предварительно подвергают химическому или ферментативному гидролизу) с ангидридом уксусной кислоты 10 и концентрированной серной кислотой реакция Либермана - Бурхарда) с последую. щим колориметрическим определением образовавшегося окрашенного соединения Е 111 ныи способ не обеспечи ифичностп и точности оп ения является увеличенточности определения. ся тем, что добавляют (сидазу и определяют по количеству поглол выделившейся пере о количеству образо- а, а связанный холе. о переводят в своферментного или ще 3 ергмайер, Эрих Бернт;,нтер Лат и Клаус БочарП р и м е р 1, Полярцметрическое опре деление расода кислорода,Применяют приспособление, которое состоит из реакционного сосуда в виде цилиндрической камеры цз транспарентной пластмассы с внутренним диаметром 143 лиц и внутренней высотой 220 лж. Камера содержит 1,8 лг раствора 18 л 1 л 1 оль иодида алия, 7,5 лисоль гептамолибдата аммония, 800 льиоль хлорида натрия и 2 У холестериноксидазы в 0,2 люоль буфера фосфата калия рН 6,0, В реакционном сосуде находится детектор, который состоит из кислород-сенситивного электрода. Детектор связан с анализатором. На дне реакционного сосуда находится магнитная мешалка. Чепез отверстие для наполнения добавляют 20 л(д водного, содержащего холестерин, раствора в качестве пробы. Во время энергичного вращения магнитной мешалки замепяют уменьшение концентрации кислорода в растворе. Поглощение кислорода, которое наблюдают через 2,5 минуты реакцци, от 45 50 55 60 потепцпометрически, полпрографпческц и олорцмегрнческц, а также ферментативцым способом. Наиболее предпочтителен ,;срментатцвный способ при использовании каталазы или пероксидазы, поскольку этот способ аратеризуется не только чрезвычайноц специфичностью и получением достовернырезультатов, цо и может быть скомбинирован с основной реакцией прп образовании перепси водорода.Особенно подходящим является способ определения с помощью каталазы в присутстш,ц такого 13-дикетона, как например, ацетплацетон и в присутствии такиниз 1 цп "опо- плц полпфгп:;цпоцальпыалцА:. тпчсскцх спиртов, как мстцловый спирт, зтнловып спирт или мстиленгликоль, а также способ определения с помощью перо- сцдазы в присутствии ромогена, При осуце твленпц способа определения в присутствии каталазы, ацетилацетона и метилового спирта последний окисляется в форальдегид, дающий с ацетилацетопом цветпу;о реацпю, по оторой может быть произведено определение. При определении с помощью пероксидазы в качестве хромофооа добавляют соединения, которые пос. ле проведения реакции могут быть определены фотомстрцчески. Примером подходящего хромофора являстся 2,2-ампнобензтиазолпнсульфокислота.Определение олестенопа производят с помощью кетореагента, преимущественно с помощью таких производных гидразина, взаимодействующих с кето-группой с образованием гпд 1 эазонов, как например, 2,4- дипптрофеццлгидразин. Однако холестепоц может оыть также определен непосредственно измерением интенсивности абсорбции в области 240 кл. 1015 20 25 30 3540 Опыт был повторен прц применениипробы сыворотки, омыленноц с помощьюспиртовой щелочи КОН. Определение далоконцентрацию 193 пг холестсрина на100 л.г. Сравнительное значение по Либермацу - Бурарду дало 182 лг/100 лл.П р и м ер 2. Определение НгО.,10 г цслого фосфата аммония растворгпот в 100 пл воды и добавлением8 э,л-пой фосфорной кислоты устанавлива.ют зна.е.ше рН раствора 7,0. Затем добавляют 10 У каталазы. Полученным такимобразом расзвором смесь 0,2 л,г ацетилацетона ц 10 я,г метанола дополняют до 100 лл.7,5 лл полученного таким образом расггора смешивают с 0,5 лл сыворотки плп0,5 ли". стандартного раствора холестерцнас содержанием 200 лг фд холестерина. Алпквот, содспжащий сыворотку пробы, а такжесоле;.яащцй холестерин пробы, смешиваютс 5 СУ холестериноксидазы и 0,02 лил 10 ОО.по о раствора Осцполпокспдодеапа и цпубпруют в течение 70 минут при 37 С.Затем замеряют фотометрическп образовавшийся краситель прп 405 нл, принимая во внимание значение при отсутствии1 сагснтов. Со стандартным раствором олестерина получают стандартную криь, ю,ца стандартной кривой концентрация хол;стегцна соотнесена к экстцнкпги при405 и.п.Содержание холестерцца, содержащегосыворотку пробы, определяют г ри использовании стандарта в качестве стандартнойвели гцны. Контрольные определсния по Лцберману - Бурхарду дали отклонения около о д.Г 0/П р ц м ер 3. Определение Н,О,.К 3 лл буфера фосфата калия рН 71 насыщенный 0), который содеряит100 лг % 2,2-а минобензтиазолццсульфокцслоты, добавляют 100 л,г 20%-ного раствора оксиполиэтоксидодекана ц 0,02 л.г1=36 У) раствора пероксидазы, а также0,02 л 1 л НО, (0,02 лил 30/о-ного Н,О, на100 лил воды) до удаления восстановленныхвеществ. Смесь проходит в фотометр при405 ни или 436 и я, Как только реакцияподходит к спокойному состоян 1 по, начинают с 0,01 лил сыворотки (1: 15 разбавленаводой) . Через 10 минут добавляют 0,15 У холестериноксидазы. Через последующие10 минут отсчитывают разницу экстинкции,Таким образом, однако при применениистапдартного раствора холестерина с содержанием холестерина 200 мг составляютстандартную кривую. С помощью стандартной кривой определяют содержание хол. -стерина пробы сыворотки. Измерения даюгсодержание 180 пг % холестерина. Контрольное измерение по Либерману - Бур.харду дает 185 лг /оП р и м е р 4. Определение холестенона.0,2 лил сыворотки (1; 10 разбавлена водой) смешивают с 0,05 лил 20 О/о-ного раст- и6370 о 7 Составптель С. Маготпат 1 пВВъ 1 ке ,"етв 11. Самки к О 1 ч а и-". г11 ПО Госуаарствеииого комитета СССР по;,спам иа. 01 етеикв и открьтип11 о;,О 1 ОСК: а:,-О, . и ИСКая Иаа.;,. Тип. Харьк. иит. пред. Патент лестерииоксидазы. Через 15 минут 2,0 лл р а створ а, содержащего 1,1;о,гь 2,4-дини грофенилгидразина добавляют в 1 н. соляную кислоту, Через последуюгцие 30 минут добавляют л 0 лгл воды и замеряют образовавшийся гидразон при 405 ни в фотометтс Опешив проводят и зависимости от стандартной кривой, принимая во внимание 05- разец без реагснта, 1,амере;ше можно про. водить также при 516 нлг после добавления щелочи.Измерение в стандартной (тшшчиой) пробе дает 60 лг ,гв свободного холестериНа И 154 Лг его ОбщЕГО ХОЛЕСтЕрниа (ОМЫ- ление спиртовым раствором КОН).Сравнительное определение по Либерман - Бурхарду дало 170 лгг" общс:холестерина.Для омыления этерифицированного холестерина (измерение общего холестерпна в сыворотке) смешивают 1 лл сыворотки.1 лл 20",с-ного раствора оксиполиэтоксидодскана и 5 лл 0,5 н. КОН в 90 сго-пом этаноле и нагревают в течение 30 минут, до 0 С. Затем раствор оставляют охла 1,- даться, смешивают с 10 лл 0,1 М раствор сульфата магния и центрифугируют. Отстой (13 л.г) содержит весь холестерин з свободном виде.Омьление этерифицированного холестерина лсберэстеразой или холестериноэстс разой происходит в результате 30-минутной инкубации сыворотки при 37 С и рН 6 - 8.П р и м е р 5, 0,.2 л,г сыворотк:1 добазляют к 2,5 лл 0,5 и. буфера фосфата натри т рН 7,5 с 0,4,4 окснполиэтоксидодека 1 иа, Определяют экстинкцию при 240 нл в подходящем спектрофотометре и начинают реакцию с 0,02 л,г (1,5 Е/) холестеринокспдазы. Чс .сз .: ми 1 у. ы снОва Опрсдсл 11 ют экстинк.ци 10. Концепт бац:1 я образозавшсгося холестено.с 11 такм образом холестерииа полут 12 Етгс ." "-21 ииы Межл 1. ПЕ:;ВЫМ И ВТОПЫМ 5 изме, 0,1 пр 11 учете молярного коэффиЦиг 1Стем 11 ота т тп ХО"СесиопПО 2.10 н,11 з мере:1 с типн Ной пробы дало58 лс ",с свооодного холсстерггна и 10 163 лаобщего холсстерина (после омы.онм яСр: вгтельное определеггие по .1 иберман - Бурхарду дало 173 лг св общего холсстсрина.15 Предлагаемьш способ обеспсч; зает высокую специфд : ость и тсность о;1 ределения свободного:1 связанного хол стс: ина з биологичсс:;х исидкостях. 20 Формула 11 зоорстспия Споссо определения свободного и сзяЗа 11:О. 0 ХОЛСС СО:1.:2 3 ОИОЛОГ 1 т 1 ссл.1 Х ЪИД- костях, отличающийся тем, что, 25 целью увслпчения спецпфичпости и точности Определения, в биологическую жидкость добазляют фермент холестерпиокс 11- дазу и оирсдсляют свободный холсстеринОГ;101 ЦСННОГО тхпсЛОРОД 2 ИЛ;1 30 выделиьшсйся псрскиси водорода, или поколицестз Оор 230 ваз 1 цегося холестенон 2, 2 СВЯЗПННЫ 1 ХОЛССТСР 11 ПРЕДВ 2 РИТСЛЬНО ПС- реводят в свободную форму путем фермент- НОГО ИЛ 1 ЩЕЛОЧНОГО ГИДРОЛИЗ 2.зо 11 сто шик ш;формаци 11, пр 1 шятыи вовн:1 ма;111 е при экспертизе:1. Предтеченский В. Е. Руководство поКЛ.1.Н 1 СКИМ Лаос Р 2 ТОРНЫМ ИССЛЕДОВ 2 НИЛМ.1 т 3 с .)