Реактив для определения холестерина

(51) М. Кл.А 61 В 10/00 6 01,й ЗЗ/16 Гееударетееккий кеиктет СССР ке делам кзебретенкй а еткрмткй(53) УДК 616-003215 (088.8) ата опубликования описания 28,05.79 Иностранцы Ханс Ульрих Бергм втер Рошлау, 11 о(72) Авторм иэобретеии Водп 4 а анг 1 Ъубер,Александр Хаген, П ер, Эрих Бернт,Ланг и Клаус Бо равная фирманигер Маннхайм ГМБХ"(71) Заивител Г) 54) РЕАКТИВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ХОЛЕСТЕРИ В ЕИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ1 2Изобретение относится к медицине н ленин количества холестерина. В первом касается диагностических средств. предпочтительном варианте этот реактивИзвестен реактив для определения хо- состоит из холестерин-оксидазы, катала лестерина в биологических жидкостях, со зы, ацетилацетона, метилового спирта и держащий активное вещество и раствори-: 5 буфера, содержащего ионы аммония, причем тать 111. указанные компоненты могут быть испольОднако такой реактив обладает недоста- эованы в отдельности или в смеси. В дру точно высокой специфичиостью, гом предпочтительном варианте реактивЦелью изобретения является повышение состоит иэ холестерии-оксидазы, пероксиспейифичности реактива. О дазы, хромогена и буфера, взятых в от 1Это достигается тем, что в качестведельности или в смеси. В качестве хромо1с активного вещества реактив содержит смесь гена предпочтительно использовать 2,2 холестерин-оксидазы, катализы. и ацетил- аминобензтиазолинсульфокислоту. ацетона, а в качестве растворителяаммо- Реактив также может сосгоять из хонийный буфер, причем компоненты взяты в 15 лестерйй-оксиаазьт и производного гидраследующем соотношении, вес.%: зина, вэаимодейсгвуюнтзго гидразина, взаХолестерин оксидаза 0,0001-0 006 имодействующего. с кетогруппой с образоКаталаза 0,001-О;06 ванием гидразина, а также в некоторых Апет илацетон 0,05-0,2 случаях иэ буфера. В качестве нроизводноАммонийный буфер Остальное. 20 го гидразина предпочтительнее использоРеактив для определения холестерина вать 2,4-динитрофенилгидразин. состоит из холестерин-оксидазы и систе- Реагенты, кроме указанных обяаателъ мы для определения .количества образовав ных составных частей, дополнительно сошейся перекиси водорода или для опреде- . держат обычные растверители, стабилиза664536 торы и поверхностно-активные вещества,Все эти добавки обычно применяютси всистемах для обнаружении перекиси водорода соответственно холестерина,Преимущественно в упомянутых вышекомбинациях реагентов отдельные состав% ф- ные части содержатся в следующих соотношениях:1. От 13 до 150 об. холестерин-оксидазы, а также от 210 ф до 5. 10 ком8мерческой каталаэы, от 9,05 до 0,2 мл; эацетилацетона и от 2 до 10 мл метилово.го спирта добавляют в 100 мл буфера,содержащего ионы аммония (рН 8-7). Загем добавляют 0,02-0,3 мл поверхност.- но-активного вещества (предпочтительно фгидроксйполиэтоксидодекана ).2. От 3 до 40 об. холестерин-оксида- .эы, а также от 2 10до 110 ф ком.мерческой пероксидазы, от 50 до 200 мг212,2 -аминобензтиазолинсульфокислоты, атакже от 0,05 до 0,5 мл поверхностноактивногб вещества (предпочтительно гидроксиполиэтоксидекана) добавляют в 100 млбуфера (рН 6-8).3. От 0,1 до 1 об.холестерин-оксидаэы, от 1 до 5 мл 1 М раствора 2,4 динитрофенилгидраэина и, в некоторых случа",ях, от 0,005 до 0,1 мл поверхностно-ак-тивного вещества.4. От 2 до 100 обьхолестерин-сксида-;эы, а также от 0,1 до 2,0 мл поверхностно-активного вещества (преимущественногидроксипОлиэтоксидодекана) добавляют в50 мл буфера (рН 5-9) преимущественнйм образом 0,5 М натрийфосфатного буфера (рН 7,5). Холестерин-оксидаза представляет собой фермент, который каталиэирует реакцию:холесте ин-оксидаза,Холестерин + 0 . - ю-40холестенон + Н 0 ,Реакция протекает количественно, благодаря чему возможно абсолютно специфическое и точное количественное определение холестерина, 4 Реактив пригоден для определения холестерина в таких водных средах, как экстракты продуктов питания жидкости, содержащиеся в теле, в особенности сыворотки. уф Благодаря большой специфичности реактива может быть произведено определение только свободного холестерина. Однако связанный холестерии, который как известно находится в этерифицированной форме, и равным образом может быть определен после предварительного химического или ферментативного омыления. Химическое 4омыление проводГт, например, под действием спиртового раствора гидроокиси калия, а ферментативное омыление - эстеразой, преимущественно холестерин-остераэой, полученной иэ печени или поджелудочной железы.П р и м е р 1. Определение по перекиси водорода,Гидрофосфат аммония (10 г) растворают в 100 мл воды и посредством прибавлейия 85%-ной фосфорной кислоты устанавливают значение рН 7;О. Затем прибавляют 10 о 5. каталазы. ПриготовленнымЮраствором доводят смесь, содержащую0,2 мл ацетилацетона и 10 мл метилового спирта, до 100 мл. Затем 7,5 мл полученного раствора смешивают с 0,5 млсыворотки, соответственно с 0,5 мл стандартного раствора холестерина, содержащего 200 мл % холестерина. Аликвотныеколичества растворов, содержащих сыворотку, а также стандаугного раствора холестерина смешивают в каждом случае с8 об. холестерин-оксидазы и 0,02 мл10%-ного раствора гидроксиполиэтоксидодекана ивыдержйвают смеси в течение70 мин при 37 С.Затем фотометрически: определяют колиество образовавшегося красители нри405 нм. Со стандартным раствором, холестерина строят калибровочную кривую.Содержание холестерина в пробе, содержащей сыворотку, ойределиют при использовании стандарта в качестве величиныдли сравнения. Контрольное определение,проведенное по Лиеберману и Бурхарду, дает отклонение примерно 5%.П р и м е р 2. Определение перекисиводорода,К 3 мл калийфосфатного буфера с рН 7(насыщен кислородом), в котором содержится 100 мг % 2,2-амийобензтиазолинсульфоксилоты, прибавляют 0,08 мл 20%-ногораствора гидроксиполиэтоксидодекана и0,02 мл коммерческого раствора пероксидазы, а также 0,02 мл перекиси водорода для удаления восстанавливающихся веществ. За смесью наблюдают с помощьюфотометра в области 405 нм или 436 нм,Как только реакция подходит к завершению, прибавляют 0,01 мл сыворотки (разбавленной водой в соотношении 1 15).Спустя 10 мин прибавляют 0,15 об. холестерин оксидазы и спустя еще 10 мин оп-ределяют разность экстинкций,Точно таким же способом, но при использовании стандартного раствора холестерина с содержанием 200 мг % строяткалибровочную кривую, С помощью этой калибровочной кривой определяют содержа ние холестерина в пробе, содержащей сы воротку, Измерение дало содержание холестерина 180 мг %. В контрольном измере , нйи по Лиеберману и Бурхарду получено значение 185 мг %.П р и м е р 3, Определение холестенона.Сыворотку (0,2 мл) разбавленную водой в соотношении 1:10, смешивают с 0,05 мл 20%-ного раствора гидроксиполиэтоксидодекана и 0,15 об. холестерин-оксидазы, По истечении 15 мин прибавляют 2,0 мл раствора, содержащего 1 М 2,4- .динитрофенилгидразина в 1 Н. солянойО кислоте, Через 30 мин прибавляют 4,0 мл воды в гидразон, замеряют в фотометре в "области 405 нм, Оценку производят по стандартной кривой, причем принимают воае внимание значения, полученные в контрольном опыте. Измерение также можно проводить в области 546 йм после добавления щелочи.Измерение, проведенное на типичнойЗУ пробе, показано 60 мг % свободного холестерина и 154 мгобщего холестерина(омыление спиртовым раствором гидроокиси калия).Проведенное для сравнения определение по Лиеберману и Бурхарду дало результат 170 мг % общего холестерина.Для омыления этерифицированного ходестерина (определение общего холестерина в сыворотке) смешивают 1 мг сыворотки, 1 мл 20%-ного раствора гидрокои полиэтоксидодекана и 5 мл 0,5 М раствора гидроокиси калия в 90%-жом этило вом спирте, Приготовленную смесь нагре" вают в течение 30 мин при 70 фС. Затем а 1 раствор охлаждают смешивают с 10 мл0,1 М раствора сернокислого магния и производят ценФрифугирование, Раствор над осадком (13 мл). содержит общий холестерин в свободной форме. 45Омыление этерифицированного холесте рина с использованием эстеразы печени, соответственно холестерин-экстеразы, производят посредством выдерживания сывоб:ротки в течение 30 мин при температуре 37 С и при рН 6-8.П р и м е р 4. Сыворотку (0,2 мл) прибавляют х 2,5 мл 0,5 М натрийфосфатного буфера рН 75, содержащего 0,4% гидроксиполиэтоксидодекана В подходящем спектрофотометре в области 240 нм определяют экстинкцию (Е) и вызывают ре акцию посредством прибавлении 0,02 мл холестерин-оксидазы, Через 2 мин ваовь определяют экстинкцию (Е). Концентрацию образовавшегося холестерина и, следовательно, содержание холестерина опре деляют по разнице между, первым и вторым. определениями, причем принимают во внимание молярный коэффициент экстинкции для холестерина при 240 нм,Измерение, проведенное на типичной пробе, показало присутствие 58 мг% свободного холестерина и 163 мг % общего холестерина (после омыления), Проведень ное для сравнения определение по Лиеберману и Бурхарду дало результат 173 мг% общего холестерина.Предлагаемый реактив является высоко- специфичным и обеспечивает быстрое определение холестерипа. формула- изобретенияРеактив для определения холестеринав биологических жидкостях, содержащийактивное вещество и растеоритель, о тличающийся тем,что,сцельюповышения его специфичности, в качествеактивного вепрства реактив содержитсмесь, холестерин-оксидазы, каталазы иацетилацетона, -а в качестве растворителя - аммонийный буфер, причем компоненты взяты в следующем соотношении, вес.%:Холестерин-оксида за 0,0001-0,006Каталаза . 0,001-0,06Лцетилацетон 0,05-0,2Аммонийный буфер ОстальноеИсточники информации, принятые вовнимание при экспертизе1. Тодоров И. Клинические лабораторные исследования в педиатрии, София,1973, с. 651, Составитель С. МалютинаРедактор Т. фадеева Техред И. Асталощ, Корректор В. Синицкаяаказ 2826/55 Тираж 671 ПодписноеЦНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений,и открытий113035, Москва, Ж, Раушская,набд. 4/5филиал ППП Патент", г. Ужгород, у. Проектная, 4