Способ получения -лейцина

(45) Дата опубликования описанияЫб 78 Государственный иомит Совета Министров ССС оо делам изобретений и открытий) Заявитель Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики селекции промышленнь 1 х микроорганизмов 4) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 1 -ЛЕЙЦИНА лейцино тетазы. нни ук стве исх ы штам. од центьф-оксалатснн анином проннлз11 р н штамм о ли испо всстные Изобрет ения 1.-лей ующих его, фермента 1 а-из нолуче в в каче чьзован как пр азанных мутантных одных штаммов бы мы дикого типа, изглутаминовой киснои среде в ленности и и питательной и корму жив тельных смес мацевтическо лоты. ния 1-лейцина известны авляет 4 - 22,1 г/л, при ктивными являются му трованные антагонистакоторых сложен, а их ьна, ровень накоплмн штаммами сос чем наиболее прод танты, отселекцион 1 Оми лейцина, синтез стоимость значител ие относится к способу полуина при выращивании продуцимикроорганизмов на питательмикробиологической промышспользуется также в качестве добавки к пищевым продуктам отных и как компонент питаей и реактивов в медицине, фарй и химической промышленности.Известны способы получения 1.-лейцина путем выращивания продуцирующих его микроорганизмов из рода ВгеиЬас 1 епцгп и Согупеьас 1 епцтп (11 РВ этих способах в качестве продуцентов 1.-лейцина применяют мутантные штаммы микроорганизмов Сог, дц 1 атп 1 сцтп, Вг, 11 ачцгп, Сог. асе 1 оасЫорЫцтп, Вг. 1 ас 1 оГеггпеп 1 цтп, генетические свойства которых обеспечивают сверхсинтез 1.-лейцина и накопление его в питательной среде, а именно: относительную потребность для роста в изолейцине, метионине, фенилаланине, валине или их смеси; резистентность к антагонистам лейцина, в частности 2-тиазолаланину и 4-алазейцину; сочетание потребности для роста в треонине, изолейцине и метионине с резистентностью к ретроингибированию лейцином и его антагонистами, в частности 2-тиазолал. Леонова и Л, ф. Козырева В известных способах в питательные среды необходимо в качестве источников ростадополнительно вводить различные гидролизаты белка, в частности соевой муки, микроб ной массы, казеина, а также экстракты дрожжей или печени.Наиболее близким решением к описываеомому изобретению по технической сущности и достигаемому результату является способ получения 1.-лейцина путем глубинного выращивания продуцирующих его микроорганизмов Вгеу 1 Ьас 1 епигп 11 ачшп на питательной среде, содержащей в качестве источни ка углерода углеводы, источник азота, ми 583 Мнеральные соли и источник рсгстовых веществ3.Однако такой способ сложен, так кактребует использования дополнительного оборудования для гидролиза белковых продуктов, и дорогостоящий за счет цспользования в селекции штамма-нродуцента дорогихреактивов (антагонистов лейцина).С целью упрощения и удешевления способа предложено из микроорганизмов Вгеч 1 Ьас 1 ег 1 цгп 1 аппп использовать цггамм вВНИИгенетика - 758, при селекции которогоне применяют антагонистов лейцина, а отбирают первичный продуцент среди ревертацтов к гомосериннезависимости у штаммапродуцента-лизина и затем вводят отобранному ревертанту мутацию зависимости отвитамина В г (или метионина), что позволяет при культивировании этого штамма и получении лейцина использовать в питательных средах в качестве источника ростовыхвеществ кормовой концентрат витамина В ьгцли кормобактерцн.Способ заключается в следующем.Куль гуру штамча ВгеЬасГегшт 1 л цшВНИИгенетцка - 758 выращивают на агарцзованной среде Хотели игера, затем выссцают в предварительно простсрилизованныевместе со средой колбы на мясоцептонныйбульон для вырагцивания посевного материала. После засева культуры колбы устанавливают на круговой качалке с 220 --240 об/мин при 30 С.Готовый посевной материал вносят в колоы с ферментационной средой, содержащейисто шики углерода, азота, ростовыхвеществ ц минеральные соли, при этом вкачестве источника ростовых веществ используют кормовой концентрат витамина ВЗ 5цли кормобактерин.Все компонецть 1 среды стерилизуют цоддавленисм, рН среды доводяг до заданной дои посте стерилизации.Фермсцтаццю проводят на указанной вы 40ше качалке прц 30 С,После образования Е-лейцина его ссдерж анне определяют методом тонкослойнойхроматографии на пластинах Яц(о.Прилер 1. Культуру штамма Вгем(Ьас 1 ег 1 шп 1 аипп ВНИИгенетика - 758 выращивают 24 ч при 30 С на агаризованной среде Хоттингера, затем петлей высевают в колбы Эрленмейера емкостью 750 мл, содержащие 30 в 100 мл мясо-пептонного бульона,включающего компоненты, вес. о/о. мяснаявода и пептон 1,0; ХаС 0,5; сахароза 1,0.Колоы вместе со средой предварительно стерцлизуют в автоклаве при 0,8 атм 30 чцц,осле засева культуры колбы устанавливают на круговую качалк с 220 - 240 ос/миц55 и выращивают посевной материал 16 ч цри 30 С. Готовый посевной материал вносят 3 1 Оо/о ( по объе му) в колбы Эрлен мейер а ечкостью 750 мл, содержащие 30 мл фермс цтаццонцой среды, состава, г/л: сахароза 100;(ХН,) 8 О, 30, КНгРО, 1,5; Мелло, 0,5, 6 С СаСО, 40; биотиц 100 мкг,л илц дестцсиотиц 300 мкг/л; кормовой концсцтрат витамина В,г 5,0; водопроводная вода.Все компоненты среды стерилизуют при 0,8 атм 30 мцн, рН среды доводят после стерилизации стерильным 25/,-ным раствором Н.БО, до 7,5.Ферментацию проводят на указанной выше качалке цри 30 С.После 60 ч в культуральной жидкости образуется3,7 г/л 1. лейцица, содержание которого определяют методом тонкослойной хроматографии на пластинах 81 п 1 о после разгонки в течение 1,2 ч в системе растворителей: этилацетат, изоцропанол, аммиак, вода в соотношении 20:20:1,5 - 25 и обработки 0,5 О/о-ным раствором нингидрина в ацетоне.При,яер 2. Культурой штамма-продуцента, выращенной на агаризованной среде согласно примеру 1, засевают колбы емкостью 750 мл, содержащие 30100 мл посевной среды следующего сос гана, г/л: сахароза 30; (ХН 4) г 80; 15; КН РО:. 0,8; МДЯО, 0,2; кукурузный экстракт О (цо сырому весу); кормовой концентрат витамина В г 10; водопроводная вода. рН среды до стерилизации доводят раствором Р 4 аОН до 7,67,8, стерилизацию среды проводя г согласно примеру 1. рН среды после стерилизации ,О 7,2.Посевной материал выращивают на качалке цри 30 С 20 ч, засев фермецтаццоццых колб и ферментацию проводя г на среде и при режиме согласно примеру 1 Г 1 осле 65 ч в культуральной жидкости образуется 13,2 г/л 1.-лейцица, определяемого согласно методике примера 1.Прилер 3. Выращивание посевного материала проводят согласно примеру 1. В составе ферментаццонцой среды цо примеру 1 кормовой концентрат витамина В г заменяют 5 г /л кормобактерцна.Режим стерилизации, засев фсрментационных колб и условия ферментации аналогичны примеру 1.После 72 ч культивирования образуется10,0 г/л 1.-лейцина, который опрсдсляют согласно методике примера 1.Пример 4. Выращивание посевного материала проводят по примеру 1.В составе фсрмсцгационной среды примера 1 кормовой коьск нтрат витамина Вг заменяют на 100 мкг,л чистого препарата витамина В,г и 200 мкг,л чистого препарата витамина В (тиамица). Все остальные условия аналогичны примеру 1.Культивируют 2 ч, в культральной жидкости образуется 10,9 г/л 1.-лсйцина, определяемого по методике примера 1,Прияер 5. Выращивание посевного ма; териала проводят согласно примеру.В составе ферментациошой среды попримеру 1 кормовой концецпрат витамина58361 фориу а изобретения Составитель А. БражниковаТехред О. Луговая Корректор А. Гриценко Тираж 568 Подписное Редактор П. ГорьковаЗаказ 3938/46 ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж.35, Раушская иаб., д. 4/5филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 гоВзаменяют на 200 мкг/л витамина Ви 300 мкг/л метионина. Все другие условия аналогичны примеру 1Культивируют 72 ч, получают 12,3 г/л 1,-лейцина в культуральной жидкости.Содержание ле йцина определяют согл асио методике примера 1. Описываемый способ получения 1-лейцина по сравнению с известным дешев, так как не требует применения дорогостоящих реактивов и вместо чистых препаратов витаминов В и Вв питательных средах могут быть использованы сухие кормовые концентраты, например кормовой концентрат витамина В 1 г или кормобактерин, и метионин, являющийся продуктом химического синтеза и выпускаемого в качестве кормовой добавки для использования в животноводстве. Описываемый способ прост, так как не требует применения оборудования для гидро- лиза белковых продуктов. Способ получения 1.-лейцина путем глубинного выращивания продуцирующих егомикроорганизмов Вгеу 1 Ьас 1 епцп 1 Пауцгп напитательной среде, содержащей в качествеисточника углерода углеводы, источник азота, минеральные соли и источник ростовыхвеществ, отличающийся тем, что, с цельюупрощения и удешевления способа, из микроорганизмов ВгечЬас 1 ег 1 цгп Пацгп исполь 1 о зуют штамм ВНИИгенетика - 758, требующий для своего развития витамин В 1 з илиметионин, при этом в качестве источникаростовых веществ используют кормовой концентрат витамина Вг или кормобактерин.Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:1. Патент США3668073,кл. 195 - 29, 1972.2. Патент Франции2264088,кл, С 12 Р 13/06, 1975.2 О 3. Патент США2264088,кл. С 12 Р 13/06, 1975.