Способ получения орготеина

ОП ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН ИЯ Союз Советских Социалистических Республик) 19.07,72 Государственный номятет Совете яянястров СССР по делам нзабретеннй,12.77 ликования описан 72) Авторы изобретения Иностранцыьфганг Хьюбер, Марк Гари Се(США) и Силвер Хьюнг Чоу Иностранная фирма Диагностик, дэйта Ин) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОРГОТЕИН тадни уда рованны Изобретение относится к области гематологии и касается получения орготеина из эритроцитов.Известен способ получения орготеина из эритроцнтов путем лизирования эритроцитов, осаж. дения гемоглобина, например этиловым алкоголем температуры .15 С, прибавления холодного 0,15 М раствора йаС 1, удаления преципитата центрифугированием при .10 С в течение 10 мил, последующе. го растворения преципитата и его прогревания при 65 С в течение 15 мин, охлаждения, повторного удаления преципита та центрифугированнем и лиофилизацией верхнего слоя жидкости, содержащей орготеин .Однако известный способ является трудоемким.С целью упрощения технологиии производства по предлагаемому способу гемоглобин осаждают путем нагревания зритропитов при температуре 60 - 80 С лри рН раствора от 6,7 до 7,5.Способ осуществляют следующим образом.Разбавляют цельную кровь примерно втрое, например 0,5 - 1,5 об.ч. воды, нагревают до 65 - 75 С в течение 1 - 8 ч, затем охлажлают нагретую смесь до температуры не менее 40 С, предпочтительно до комн.ной или более низкой. Отделяют осажденные белки центрифугировапием, вьщеляют из верхнегослоя жидкости орготеин посредством хроматографии с применением ионообменных смол.В другом варианте получают орготенн следую.шим образом,На первой стадии эритроциты, не содержащиесыворотки крови, суспендированные с 1 - 3 об ч.воды, используют в качестве исходного материаладля нагревания. Нагревание проводят при 60 С в1 О течение 3 - х или более часов и прн более высокойтемпературе, например, 80 С - от 30 мин до 1 ч.Значение рН при нагревании -7,Охлаждают нагретую смесь после отделенияосажденных белков или одновременно с осажде.15 нием, орготеин выделяют из верхнего слоя жидкости осаждением ацетоном или другим органическим растворителем, смешивающимся с водой, иультрафильтрованием или лиофольной сушкой.Часть воды удаляют из верхнего слоя жидкости20 перед выделением орготеина вакуумной перегонкой, налример, при температуре 20 - 60 С.Поскольку нагреванию подвергают цельнуюкровь, то устраняется необходимость в слення сыворотки и промывания консерви х25 эритроцитов. Эту стадию можно осуществлять гприменением эритроцитов, не содержаших сыворот.ки, но предпочтительным исходным материаломявляется цельная кровь.Цельную кровь и особенно эритроциты, не содержащие сыворотки, смешивают с водой (например, 1 - 2 об.ч.) перед нагреванием, Вода можетсодержать буфер или ионы двухвалентного металла,например меди или цинка, при небольших концентрациях, например, ниже 0,5 М. При использовании цельной крови добавляют тринатрийцитратили другой ингибчтор свертывания для предотвра.щения свертывания крови перед лиэисом гемоглобина., Значение рН при нагреваю и равно 7. При болеенизких значениях рН, например ниже 5, гемоглобинденатурируется, осаждается лишь частично. Значение рН эритроцитов регулируют добавлением подходящего количества кислоты или основания.Стадию нагревания ведут при температуре-60 - 80 С, прецпочтительно 70 - 75 С, до осажде.ния всего или почти всего гемоглобина. Повышениетемпературы и более длительное нагревание способствуют снижению общего выхода орготеина,Более низкая температура и короткое нагреваниеприводят к получению менее чистого орготеина.При 75 С нагревание ведут 1-2 ч. Стадию нагрева.ния можно осуществлять периодически или непре.рывно.Термолабильные белки, в том числе ферменты,удаляют из эритроцитов путем термоденатурациивместе с гемоглобином. Основным компонентомтаких термолабильных белков является карбоангидраэа. Эритроциты нагревают до инактивирования карбоангидразы.При осаждении гемоглобина карбоангидраза ибольшинство других термолабильных ферментов ибелков неферментного происхождения в верхнемслое жидкости также осаждаются, ввиду того, чтогемоглобин более стоек.Полноту осаждения гемоглобина устанавливаютпо окрашиванию верхнего слоя жидкости, которая, становится бледно. розовой,При использовании старой крови возможныслучаи, когда все окрашенные вещества гемоглобийа могут не осадиться, если стадию нагревания1осуществляют в кислой среде, Если это происходитперед или после удаления гемоглобина, осажденного на стадии нагревания; то любые остаточныеокрашивающие вещества можно осадить доведе.нием значения рН до 7 или до 7,5 перед осаждениеморготеина, Осажденные вещества красного цветаудаляют таким же образом, как при осаждениигемоглобина на стадии нагревания. После нагревания эритроциты охлаждают до температуры ниже50 С, предпочтительно до комнатной температуры,пропусканием через теплообменник. Гемоглобин идругие белки, осажденные на стадии нагревания,удаляют центрифугированием и отбрасывают (можно также использовать отстаивание или фильтро.. ванне). После удаления осажденного гемоглобина вы.деляют орготеин из верхнего слоя жидкости, на.пример, добавлением ацетона к охлажденному раст.вору, лиофилиэацией, ультрафильтрованием или же 5 адсорбцией на колонке с ионообменной смолой споследующим элюированием. Предпочтительнее всего выделять орготеин ионообменной хроматографией.Выделять орготеин можно пропусканием верхнего слоя жидкости, полученного на стадии нагревания, через ДЭАЭ целлюлозу. Верхний слой жидкости можно также подвергать очистке с использо.ванием молекулярноситовой хроматографии, на.пример, пропусканием через колонку, заполненную декстрановой смолой, сшитой эпихлоргидрином.Неочищенный.орготеин, содержащийся в верхнем слое жидкости, подвергают очистке путем избирательного выпаривания инородных белков, предпочтительно с протеиназой, Ятгер, дгаеив с панкреатином, субтилизином, попаином или бромелиаином при весовом соотношении фермента и белков в верхнем слое жидкости примерно от 1:2 цо 1:1000, в зависимости от выбранного фермента и соотношения инородных белков и орготеина в смеси, Чистый орготеин выделяют из смеси, например, ультрафильтрованием. Остатки белков и избыток ионов удаляют из варочной смеси диализом перед выделением иэ этой смеси орготеина,После удаления осажденных посторонних бел.ков орготеин осаждают остаточным количеством ацетона - от 3/4 до 1,5 об.ч. в расчете на водный раствор.Предварительное осаждение посторонних бел.ков и орготеина проводят на холоду, например при З 5 0 - 5 С, но можно его проводить и при комнатнойтемпературе до точки кипения ацетона, Осажденный орготеин отделяют от остаточного количества растворителя и влаги, например, сушкой, вымораживанием или лиофилиэацией или же повторным раство рением в водном связующем для последующейочистки во избежание потерь орготеина.П р.и м е р 1, Промытые эритроциты быковлизируют двукратным объемом воды, содержащей 1 мг двухвалентной меди и 1 мг двухвалентного 45 цинка на 5 мг орготеина, находящегося в эритроци.тах, и нагревают до 70 - 75 С в течение 1 - 2 ч при значении рН, т.е. при изоэлектрической точке гемоглобина. Разбавляют в 2 - 3 раза, охлаждают и центрифугируют полученный шлам при температуре 50 4 С. Верхний слой жидкости, полученный послецентрифугирования и содержащий в значительной степени очищенный орготеин, подвергают дналиэу и лиофилиэируют, Выход орготеина 70%,П р и м е р 2, Суспендируют промытые консер.55 вированные эритроциты, замороженные и не содержащие сыворотки, в двойном (по объему) количестве воды. Подкисляют до рН 5,5 уксусной кислотой, Суспензию нагревают 15 мин при 65 С. Полученную жидкость охлаждают цо температуры ок ружаюшей среды (или более низкой температуры)578836 Сосзави гель С. МалютинаТехред М. 11 евицкая Редактор Н. Хбларова Корректор Н. Яиемирсквя Заказ 3815/705 Тираж 677 Подписное ИНИИПИ 1 осуцарственного комитета Совета Министров СССР по цепам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж - 35, Раушская наб., 4/5Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 и удаляют осажденные белки 11 ентрифугированием, Доводят рН до 7,5 с целью осаждения веществ, окрашенных в красный цвет, и центрифутируют. Верхний слой жидкости после центрифутирования смеищвают с 3/4 объема ацетона, охлажденного льдом, центрифутнруют и осадок отбрасывают. Добавляют вторую порцию 3/4 объема холодного ацетона, центрифутируют и отделяют осадок, содержа. щий " 5 орготеина. Для сохранения неочищенного орготеина осадок подвергают сушке вымораживанием, а затем его лиофилизируют.П р и м е р 3, Используют эритроциты челове. ка, быков, лошадей, кур, овец или свиней, Методика аналогична примеру 2, но осаждение ацетоном заменяют на ферментативное переваривание белковых примесей, например, добавлением к верхнему слою жидкости после стадии нагревания 1 - 3 мг панкреатина на 1 мл исходных консервированных эритроцитов и выдерживания смеси при 37 С в течение 15 - 48 ч, В результате происходит переваривание почти всех белков, за исключением орго. теина, на небольшие днализуемые фрагменты. Из полученной смеси путем ультрафильтрования выделяют в значительной степени очищенный орготеин.П р и м е р 4. Следуют методике, описанной в примере 1, но в качестве исходного материала применяют цельную кровь, стабилизированную против коагуляции цитратом натрия. Смешивают 2 об.ч, свежей бычьей крови (85 мг/мл общего белка, 20 мг/мл орготеина) и 1 об.ч. 3,8% - ного водного раствора тринатрийцитрата с .2 об.ч. воды, содержа. щей 25 мг/мл двухвалентной меди и 25 мг/мл двухвалентного цинка. Получают раствор цельйой крови, содержащей 1000 мг ионов двухвалентной меди и двухвалентного цинка на 100 мл. Раствор нагревают до 75 С и выдерживают при этой температуре 2 ч. Затем охлаждают до -10 С добавлением 150 мл ледяной воды. Это разбавление устраняет необходимость отдельной стадии промывки после центрифугирования. Центрифугируют и отделяют верхний слой жидкости, содержащий 1,6 мг/млбелка и 12 - 17 мг/мл орготеина, что представляет собой 40 - кратную очистку и извлечение 70% орготеина исходной крови. При использовании непромытых эритроцитов (90 мг/мл общего белка) вместо цельной крови извлекают 9 орготеина, Очищенный орготеин вьщеляют иэ верхнего слоя жидкости лиофилизацией, или фильтрованием через молекулярное сито, или хроматографией с приме.нением ДЭАЭ целлюлозы.Для последующей очистки орготеина смешивают 50 мл верхнего слоя жидкости после стадии термической очистки, содержащей 12-17 мг/мл 10 орготеина, с 50 - 150 мг панкреатина и 0,1% аэнданатрия (для предотвращения роста бактерий) и выдерживают при температуре 37 С в течение 15 ч, после чего охлаждают. Получают раствор, содержащий 1 мг/мл общего белка и 12 мг/мл орготеина.15 Неочищенный орготеин можно выделить.в чис.том состоянии путем хроматографии через гель из молекулярного сита пропусканием 2 - 5 г неочишен.ного орготеина через колонку размером 3,2 ему 38,5 см, заполненную сверхтонким Сефа.20 дексом (3 - 75, представляющим собой декстряно.вую смолу, сшитую эпнхлоргидрином. Собирают элюат на фракции по 5,4 мл и определяют их поглощение, Начиная примерно с 50 - ой фракции, кривая поглощения круто поднимается, достигая 75 пика примерно на 68 - ой фракции, Фракции 66 -73содержат большую часть всего орготеина в ультра.чистом состоянии. 30 Формула изобретения Способ получения орготеина путем лиэированияэритроцитов, осаждения, прогревания гемоглобина и других термолабильных белков, охлаждения, 35 очистки и выделения целевого продукта иэ верхне.го слоя жидкости, о тл и чающий ся тем, что, с целью упрощения технологии производства, гемоглобин осаждают путем нагревания эритроиитов при температуре 60 - 80 С при рН раствора от 6,7 до 40 7,5. Источники информации, принятые во вниманиепри экспертизе: 1. Патент США У 3579495, кл. 260 - 15, 1971.