Способ определения нитритов, нитритобразующих и нитрифицирующих микроорганизмов

Свез лветских Сецк алистическиу Республик(46) Дата опубликования описания 30,09.77(51) М. КлРС 01. В 21/50 б 01 М 31/22 аауйарстаееый ааветат .Вавата Маяастраа СССРеа двлам азабратанайЗФ атарытий 3) УДК 543546.173(73) Заявитель аучно-исследовательский институт химии при Горьковскомгосударственном университете им. Н, И, Лобачевского ОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НИТРИТОВ,НИТРИТОБРАЗУЮЩИХ НИТРИФИЦИРУЮЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ использ неизменных Известе недостаткиИзобретение относится к способам определения ннтритов, а также нитритобразуюших3 тающ тР6 тьисиольэовакодля контроля процессов биологической очистки окружающей среды, в 3 часщостк сточных вод промышленных предприятий, а такжев медицинской лрактяке для ускоренйого выявления нитритобраэуюших бактерий и диагностики бактериальной инфекции.16 Известен способ определения нитритов, которйй основан на реакциях диазотирования, с применением органического реагента и аэосочетанияс образованием азокрасите- ляЦ.15В основе этого способа лежит реакция диазотирования сульфаниловой кислоты присутствуюшими в пробе иитритами и взаимодействие полученной соли диазония с д, нафтиламином сопровождающееся обраэова нием красно-фиолетового аэокрасителя.Одним из недостатков известного способа, в основе которого лежит проба Грисса, является тот, что исходные реагенты реактива Грисса нестабильны. Это требует , 25 ия стандартных реактивов, в каждой новой пробе.способ частично устраняюший пробы Грнсса 12) Указанный способ основан на реакции бис- диазотирования бенэидина, с образова-,. нием диазоаминосоединення которое, диспропорцнонируя, сочетается см феннлэнднамином с образованием красителя. Способ позволяет повысить стабильность окраски во времени.Этот способ также имеет ряд недостатков. Реакция образования диазоаминосоединения протекает через ряд промежуточных этапов. Соответственно возрастает время образования диаэоаминосоединения и необходимо строго выдерживать время диазотирования. Необходимо строго соблюдать рН среды и определенные низкие концентрации нитритов. Реакция подчиняется закону Бэра и в пределах 0,2-8,0 мкг Й 02 в 3 мл пробы. Для определения больших концентраций необходимо раэбввление пробы. Время проведения сочетания диазоаминосоеди ения с фенилеидявмином строго 1 лимити, ровано, ие менее 15 мин.Наиболее близким к предлагаемому является способ определения нитритов, который основан ив реакциях дивзотирования. В ка . честве ревгента в реакциях азосочетания используют 1-фенилнафтиламин -8- сульфокиологу 3 .Укаэанмый способ является количественным способом определения аниона азотистой ч 10 кислоты и имеет более высокую чувствитепь. ность, чем другие известные, но он сохраняет основные недостатки пробы Грисса таиие ваи медленное нарастание интенсивности окраски вэокрасителя ( 40 мин.) и,;5 следовательно длительность опыта и нестабальиость окраски во времени, сильное влияие рН среды на окраску аэокрасителя.Белью настояшего изобретения является сокращение времени анализа и повышение 20 стабильности окраски в среде с различным значением рН.С этой целью в качестве реагента реакции диаэотирования используют оС -нафтила-,25 мин, а в реакции азосочетания - к -нафтол.Процесс диаэотировання и азосочетания иллюстрируется следуюшими уравнениями:. НОНОЙФСЮКТЙН 2+ 2 Н СОНТЙ я И+2 НТО СюНН й Ф СоНтОН ОН рЯ 7 й Й СоН ОН Диаэотнрование подчиняется известным закономерностям, в частности требует кислу 1 о среду (РН2-3). Для азосочетання необходима концентрация ионов ОН в З 5 соответствии с уравнением. Избыток щелочи на аэосочетание и устойчивость окраски вэокрасителя не влияет, Окраска раствора взокрасителя (при РН Ъ 8-9) стабилизуется в течение 3 мин и устойчива в течение 40 длительного времени - не менее 24 час.П р и м е р. 1. К 5 мл испытуемого раствора добавляют 1 мл 0,1 % раствораос - нафтиламина в 0,5 К растворе соляной кислоты (РН 2-3). Через 5 мин. 5 добавляют 1,6 мл 0,1 % раствора ос -наф-; тода в 0,5 й растворе КОН (РН 8-9), перемешивают и через 3 мин измеряют оптическую плотность (Д) на спектро-фотометре при длине волны 505 Нм в кювете тод шиной слоя 0,5 см относительного нулевого раствора.Калибровочный график построен с ннтритом натрия ддя концентраиий 0,5-10 мкг/мл. Оптическая плотность возрастает прямо про.,55. порционально с увеличением концентрации.По снособу с использованием пробы Грисса интенсивность окраски азокраснтеля в теЧение 3-30 мин нарастает, что соответствует увеличению концентрации определяемых ннт 60 ритов на 1 мкг/мд, через 24 час появляется осадок.Нарастание интенсивности окраски азокрасителя после начала измерений, после 3-х мин, не происходит, Для концентраций 5 мкг/мл погрешность метода 5,010,03 мкгlм 1 а соответствующая погрешность определения нитрнтов из временной зависимости 5,0 + 0,017 мкг/мл. Для введенной концентрации нитритов 10 мкг/мл соответствующие значения погрешности метода 10 + +0,1 мкг/мл, а погрешности определения 9,99+ 0,09 мкг/ мд Окраска азокрасителя устойчива в течение 24 час. Изменения оптической плотности и определяемых концентраций нитритов лежат в пределы погрешности метода.П р и м е р 2. Используют те же условия измерений, что и в примере 1, но оптическую плотность азокрасителя для концентраций нитритов 0,05 - 1,0 мкг/мл измеряют в 2 см, кювете и по калибровочному графику находят искомые концентрации нитритов в пробе. Чувствительность определения может быть существенно увеличена.П р и м е р 3. Использование смесиос - нвфтола и сс -нафтиламина в 0,5 М КОН обеспечивает возможность длительного сохранения реагентов. К 2 мл смеси 0,1 % раствора О -нафтиламина и 0,1 % раствора х: -нафтола добавляют 5 мл исследуемого раствора и после диаэотирования добавляют 3 мл 0,5 Ч КОН. Затем процесс протекает, как в примере 1.П р и м е р 4. Способ по примеру 1 использован для определения нитритобразу 3 о. ших микроорганизмов в аэротенках очистных сооружений, В промстоках, подаваемых на микробиологическую очистку, содержится в среднем 0,024 г/л аммонийного азота впересчете на КН 4 (опредепение про.одили с реактлть,м Несслерв по известной методике), а в очишенных стоках вммонийного азота - 0004 г/и, нитритов0,00011 г/л. Это свидетельствует о присущ.ствии нитрит-образующей микрофлоры. Припосеве мнкрофлоры очистных сооружений(10 мл) на селективную среду (150 мл),содержащую г: КНРО 4 1; МЯ В 04 0,5; ЧаС 1 2; Гео 0, 0,4; СаСО 5; в качест ве единственного источника энергии и азо та (И Н 4) 04 2 г в 1 д отмечено накопление нитритов. Длительное культивирование в течение 10 дней при 27 С обеспечивает накоплю нне 0,006 г/л ннтритов, а при культивировании 30 дней накапливается ао. 0,5 г/л нитритов.567665 Составитель А. ЖаворонковаРедактор Л. Курасова Техред О. Луговая Корректор С. Юдченко Заказ 2678/14 Тираж 658 Подписное ПНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 5П р и м е р 5, Способ по примеру 1 использован для определения ннтрнфицируюшнх микроорганизмов, Питательная среда содержитг: й а СОЗ(безводного) 1 г;К аС 1 0,5; К НРО 0,5 МДВО 0,5е 5 0 0,4; Н;,О дистилированной 1 л и содержит в качестве единственного источ- источника энергии, и азота К а НО 1 г. среду , заражают культурой Ж(Сгобас 1 ег Мйпор гаййу ВКМ В. В контроле (без культуры)содержание нитритов в тече ние 4 дней не изменяется. В опыте конпен 1трация нитритов, уменьшается до 0,1 г/л. Высокая чувствительность предлагаемого способа наряду с большой скоростью опреде ленин нитритов позволяет использовать способ для непрерывного контроля,Предлагаемый способ позволяет в 10 раз (до 3 мин) сократитьпродолжительность определения нитрнтов с использованием пробы Грисса, обеспечивает стабильную окраску азокрасителя в течение 48 час и более в среде с различным значением рН. Формула изобретенииСпособ определения нитритов, нитритообразуюших и нитрифицирувщих микроорганизмов, основанный на реакциях диазотирования с применением органического реагента и азосочетания с образованием аэокрасителя, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью сокрашения времени анализа и повышения стабильности окраски в среде с различным значением рН, в качестве реагента в реакции диаэотирования используютос -нафтиламин, а в реакции азосочета ния- ос-нафтол. 5Источннкн информации, аринятые во вни.мание прн экспертизе:1, Унифицированныеметоды анализа вод,под ред. Лурье Ю. Ю., Иэд. ф Химияф,1973, с. 136.2. Узбекский хнмич.журнал, )я 3, 1973,с, 18-20.3. Авторское свидетельство М 395751,кл. 9 01 Й 21/24, 1972.