Способ диагностики туберкулеза

Союз Советских Социалистических Ресвублик(23) ПриоритетОпубликовано 30,03.77. осударственныи комитет ета Министров СССРделам изобретений 3) УДК 616-002.5(088,8) летень Ме Дата опубликования описания 15,04.7 н открыт 2) Авторы изобретени(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА Изобретение относится к медицине и биологии, а именно к иммунологическим способам определения минимальной активности туберкулеза.Среди иммунологических способов известен способ реакции торможения миграции,Способ основан на феномене торможения миграции клеток 1 п и 1 чо (макрофагов, лейкоцитов), полученных от животного или человека и помещенных в стеклянные капилляры и питательную среду со специфическим анти- геном. Необходимым условием является то, чтобы организм животного или человека был сенсибилизирован (иммунизирован) этим антигеном.Известен также способ определения активности туберкулезного процесса, заключающийся в том, что проводят реакцию торможения туберкулином миграции лейкоцитов крови больного.Однако известные способы не обеспечивают высокой точности диагностики,С целью повышения точности диагностики после определения степени торможения миграции лейкоцитов пациенту вводят туберкулин, повторно определяют степень торможения миграции и сравнивают показатели.Способ осуществляют следующим образом.Реакцию ставят с лейкоцитами периферической крови больного туберкулезом. Кровь забирают из локтевои вены сухимстерильным шприцем в количестве 10 - 12 мл и переносят возле пламени горелки в стерильную двадцатимиллилитровую пробирку, в ко торую предварительно помещают растворенный в 0,5 мл питательной среды гепарин (сухой СПОФА или жидкий Гедеон-Рихтер) в таком количестве, чтобы обеспечить конечную концентрацию 25 единиц гипарина на 1 мл 10 крови. Кровь быстро перемешивают с гепарином для предупреждения свертывания, затем (все дальнейшие процедуры проводят в стерильном боксе со стерильной посудой) в нее добавляют 0,6 - 0,7 мл стерильной 10/о-ной 15 желатины, вновь перемешивают пастеровскойпипеткой и ставят в термостат при 37"С на 25 - 30 мин для отстаивания эритроцитов. Забирают весь слой плазмы с лейкоцитами в охлажденную стерильную центрифужную про бирку объемом в 10 мл. Пробирку с плазмойцентрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 мин. Плазму сливают, клеточный осадок взвешивают в 5,0 мл гипотонического раствора (0,35/о) ХаС 1 для лизированпя оставшихся 25 эритроцитов и пппетизируют в течение 30 -40 сек. Затем в смесь быстро добавляют 0,6 мл 5%-ного раствора ХаС 1, в результате чего раствор становится изотонпчным. Смесь в этой же пробирке вновь центрпфугируют при 30 тех же режимах, надосадок опять сливают и косадку добавляют питательную среду199 в количестве 5,0 - 6,0 мл, в которой осадок взвешивают пастеровской пипеткой (эта процедура служит для отмывания клеток). Смесь ,вновь центрифугируют при тех же режимах.Последний этап с взвешиванием в среде199 для тех же целей повторяют еще раз. Затем надосадок сливают, а оставшийся клеточный осадок осторожно размешивают в оставленной капле среды стеклянным капилляром (с внутренним сечением 1,0 - 1,2 мм и длиной 15 см) и набирают в эти стеклянные капилляры (примерно до половины их длины). Количество капилляров зависит от величины клеточного осадка. Свободный (незаполненный) конец капилляра расплавляют в пламени горелки (на расстоянии 1,0 см от границы клеток) и запаивают. Капилляры запаянным концом вниз помещают в стерильные сухие центрифужные пробирки и центрифугируют при 700 об/мин в течение 5 мин, В это время готовят камеры, в,которые затем будут помещены капилляры. Камеры представляют из себя кольца из органического стекла с внутренним диаметром 1,6 - 1,8 см и высотой стенки 0,8 - 1,0 см. Эти кольца (по 8 штук) плашмя наклеивают на стеклянную пластинку (размером 9,0)(12,0 см) смесью расплавленных парафина с воском (4 части парафина +1 часть воска) таким образом, что стеклянная пластинка служит дном вновь образованных камер. После застывания смеси парафина с воском кольца оказываются прочно приклеенными.После центрифугирования капилляров клетки располагаются внизу, у запаянного конца капилляров, в виде осадка. Прокаленным на огне резачком отрезают точно на границе осадка с жидкостью часть капилляра с осадком клеток (остальную часть выбрасывают) и нарезают на кусочки длиной 0,7 см, которые помещают на дно приготовленных камер так, чтобы один конец кусочка соприкасался со стеной камеры (его приклеивают к ней указанной смесью парафина с воском), а другой свободно смотрел в середину камеры. Камеру тут же заливают 1,5 мл культуральной жидкости (смесью среды199 и сыворотки крупного рогатого скота при соотношении 4: 1). Обычно в такую камеру помещают два кусочка капилляра с клеточным осадком. Аналогичных камер может быть две-три. Описанные камеры представляют собой контроль реакции, где клетки в дальнейшем свободно мигрируют по дну камеры, образуя хорошо заметный венчик (зону) миграции на прозрачном стекле, служащим дном камеры. В опытные варианты реакции (две-три камеры) с такими же кусочками капилляров, содержащими испытуемые клетки, вносят такое же количество культуральной жидкости, включающей еще и разведенный туберкулин (РРР., сухой, лиофилизированный, Ленинградский) в соответствующей концентрации (1: 100). Все камеры сверху закрывают покровными тонкими5 10 15 20 25 30 35 40 45 50556065 стеклышками размером 18,0;(18,0 мм, которые приклеивают к верхним краям камер стерильным вазелином. После этого камеры помещают в термостат при 37 С на 1 сутки. За это время клетки из капилляров мигрируют по стеклу (дну камеры).Положительным результатом реакции считается тот, при котором в опытных камерах, содержащих туберкулин, зона миграции клеток меньше, чем в контрольных, не содержащих туберкулин. Для регистрации результата высчитывается индекс реакции (1).Для этого вытаскивают камеры из термостата (через сутки после постановки реакции), снимают покровные стекла и помещают камеры в фотоувеличитель (на место рамки с негативом), так чтобы камера и зона миграции клеток проецировалась на стол, на бумагу. Все зоны миграции зарисовывайт на бумагу и шифруют. После этого их переносят на стандартную засвеченную фотопленку, кусочки фотопленки с зоной миграции вырезают (по краям проецируемой зоны миграции) и взвешивают в две порции отдельно: контроли и опыты. После чего высчитывают индекс реакции по формуле:у О где Р, - вес кусочков пленок с зоной миграции из опытных камер,Р - вес кусочков пленок с зоной миграции из контрольных камер.Если индекс равен 1,0, следовательно, торможения миграции клеток в опытных камерах, содержащих туберкулин, не произошло; Чем меньше индекс, тем выраженнее задержка миграции в опыте.Наиболее низкие индексом реакции получаются у больных явно активным туберкулезом в фазе вспышки (обострения) процесса. По мере лечения и рассасывания туберкулезных поражений индекс повышается и становится близким к 1,0, т. е. реакция становится отрицательной. При нормальном разбросе вариационного ряда показателей (индексов) реакций торможения миграции у здоровых людей, при 95% вероятности статистического обсчета; индекс может считаться сниженным (положительная реакция), у больных же туберкулезом (по отношению к здоровой группе людей) - если он (индекс) равен 0,8 и ниже. При лече. нии туберкулеза реакция становиться отрицательной (индекс 0,8 и выше) уже тогда, когда активность болезни еще сохранена по клиническим данным. Таким образом, недостатком описаннои реакции является непригодность ее при малых формах туберкулеза с минимальной (скрытой) активностью.С целью повышения точности диагностикиописанную выше модифицированную методикуреакции торможения миграции дополняют следующими моментами; реакцию ставят двукратно, а после первой постановки больномутуберкулезом вводят подкожно 20 - 50 ТЕВ 52074 Составитель С. МалютинаТехред А. Овчинникова Корректор И. Позняковская Редактор М. Дмитриева Заказ 760/2 Изд. Мо 329 Тираж 654 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5(международных единиц) туберкулина в зависимости от возраста (20 ТЕ - детям и подросткам, 50 ТЕ - взрослым). Через 48 час после введения туберкулина у больного вновь забирают из вены кровь и реакция торможения миграции ставится повторно. При чтении результатов увеличивается разница между показателями первичной и повторной постановок реакции,Учет результатов при двукратной постановке модифицированной реакции торможения миграции производят следующим способом, Диагноз наличия даже минимальной активности туберкулеза (обследовано 127 человек активным туберкулезом и с неактивными туберкулезными изменениями в легких) ставился при переходе реакции из отрицательной (индекс 0,8 и выше) в положительную (индекс ниже 0,8), причем разница между показателями должна быть не менее 0,1.Предлагаемый способ обеспечивает высокую 5 эффективность диагностики минимальной активности туберкулеза (до 92,3/о) и имеет большое практическое значение. Формула изобретения10 Способ диагностики туберкулеза по торможению туберкулином миграции лейкоцитов крови, отличающийся тем, что, с целью повышения точности диагностики, после определения степени торможения миграции лейко цитов пациенту вводят туберкулин, повторноопределяют степень торможения миграции и сравнивают показатели,