Способ количественного определения энзимов гидролитического действия

ОПИСАНИЕ 11 б 1 б 471ИЗОБРЕТЕН ИЯ Союз Советских Социалистицеских Республик(32) 16,08.7 сударственный номнте авета Министров ССС по делам изобретенийи открытий Ф) СЪА5 76 Бюллетень 19 43,42, 0(45) Дата опубликования описания 13,10,76 72) Автор изобретен ИностранецРоберт Юджин Смит (СНА(71) Заявитель 4) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕ ГИДРОЛИТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИ НЗИМОВ обретение стносится к с обам опре- именением 5 е, одну 0 было во ем ипа.метокже ти 5 ные деления концентраций энзима с пр4 метокси 2 нафтиламидов.Известен способ количественного определения энзимов гидролитического действия,например трипсина, путем дсбавления к исследуемой пробе субстрат-буферного раствора, в котором в качестве субстрата исползуют тт -нитроанилид- ЙЬ -бензоил Э,1,аргинин, инкубирования смеси в течениео10 мин при 25 С, введения соляной кислоты, раствора нитрита натрия и через 5 минраствора сульфаминовой кислоты с последующими добавлением содового растворахромотроповой кислоты, выдерживанием псмлученной смеси в течение 5 мин, фотометрированием и определением Количества энзима по калибровочному графику,Однако известный способ обладает невысокой чувствительностью,С целью повышения точности определения, предлагается в качестве субстратовгидролитического действия энзимов использовать Я -аминокислотные производные4-метокси 2-нафтиламида обшей формулы где К с одержит п о меньше и мергруппировку аминокислоты.Способ определения энзимов гидролити ческого действия состоит в том, что к пробе анализируемого вещества добавляют М аминокислотное производное 4-метокси 2 нафтиламида, инкубируют полученную смесь с последующими введением в получен ный раствор средства, образующего краситель, фотометрированием и определением энзима по калибровочному графику,определения концентраций энзимов именено весьма большое количестетоксилированных соединений данног айдено, что в результате введения радикала эти соединения известного а приобретают существенно улучшен йства в отношении определения кон(таких, как сыворотка или экстракты тканей).К метоксилированным соединениям предпочтительно добавлять буфер. обеспечиваю.ший поддержание оптимального или близкогок нему значения водородного показателядля данного энзима.Если нужно содействовать процессу солюбилизации соединения,.то можно также добавлять пропиленгликоль,Эту смесь смешивают с гомогенатом, содержвшим энзим, подлежащий определению,после чего дают энзиму обеспечивать гидролиз соединения,После проведения гидролиза в течениеопределенного промежутка времени добавляют денатурируюшее соединение, такое какхлористоводородная или трихлоруксуснаякислота, для прекращения гидролиза, Послеудаления осадка любого вида, который может образоваться, добавляют средство, способное образовывать краситель с любым4-метокси 2 нафгиламином, который имеется в наличии вследствие энзиматическогогидролиза субстрата.Типичными средствами для образования 25красителя служат "прочный синий (тетразотированный ди.о анизидин),прочныйгарнет (дивзотированный 4 Омгоидазс сьтолуидин), прочный синий (диазотированный4 амино 2,5-диэтоксибензинилид)и гексазотированный парарозанилин.После образования .красителя определяютконцентрацию красителя фотометрическипосредством пропускания светового лучазаданной интенсивности через смесь, ссьдержавшую краситель, после чего измеряютинтенсивность светового луча, прошедшегочерез смесь, Данную концентрацию энзимвопределяют путем сравнения со стандартной кривой, полученной путем проведения 40ряда аналогичных определений с известнымиконцентрациями энзимов,П р и м е р. Подлежашую инкубиоованиюсмесь готовят, сливая 1,5 мл субстрат,буфера одного из типов, перечисленных 45ниже, 0,3 мл препарата ткани или сыворотки и 1,2 мл 0,85 н. солевого раствора в пробирки,Пробирки закрывают колпачком и инкубируют 2 час при 37 С на водяной бане, 50После инкубирования снимают колпачкии прекращают реакцию с энзимом путемдобавления 0,5 мл 10%-ного раствора трихлоруксусной кислоты, причем образуюшийсяосадок удаляют центрифугированием, 55В каждую пробирку вводят 1,0 мл водного расгвора, в 1 мл которого содержится 1 мг красителяпрочного синего.Затем пробирки, подвергают вибрационному воздействию в течение 15 30 сек, 60 после чего спустя 5 мин производят спект рофотометрическое определение при 520 ммк по отношению к пустой пробе. Ко личество высвободившегося 4 метокси 2 нафтиламина отсчитывают по ранее приго товленнойстандартной" кривой, отградуи рованной по 4-метокси 2 нафтиламину в пр ису.гствии рецептур, содержаших сыво ротку или ткани.В приведенном процессе можно использьвать следующие субстрат-буферы.Для определения обшей активности аминопентидазь: применяют лейцил 4 .меток си 2-нафгиламид. 32,3 мг упомянутого соединения добавляют к 50 мп воды и сме шивают с одинаковым объемом О, 2 М фосфат,- ного буфера, рН 7, О, для образования суб страт-буферного раствора.Для определения активности дипептидиламичопетидазы (степень активности П) найденной в лизо,:вх клеток итоиидной железы, применяютлизилаланил 4 метоксинафгаламид, 43,4 мг упомянутого соединения добавляют к 50 мл воды и смешивают с равным объемом 0,2 М натрий какодила тного буфера рН 5, 5, содержащего Оьмл хлористоводородной соли меркаптоэтиламина в виде 1,0 М раствора, для образования субстрат-буферного раствора,Для определения активности дипептиди ламинопептидазы (степень активности 1 квтепсин С) применяют пропиларгинил 4 метокси 2 нвфтиламид. 52, О мг упомянутого соединения добавляют к 50 мл воды и смешивают с равным объемом 0,2 М натрийквксдилвткого, буфера, рН 5,5,со держащего О, 5 мл О, 1 М раствора хло ристоводородной соли меркаптоэтиламина, для образования субстрат-буферного раство ра.Для определения активности дипептиди ламинопентидезы (степень активности ХУ) применяют глицилпропил 4 метоксинафтиламид. 43, 0 мг упомянутого соединения добавляют к 50 мл воды и смешивают с равным объемом О, 1 М трио-хлористоводсьродного буфера, рН 7,5, для получения субстрат буферного раствора ("трис ознв чает 2-аминсь.2-оксиметил 1,3-лропвндиол, поставляемый иностранной фирмой Истмен Кем икелс ) . Для определения активной дипептидила минопептидазы (степень активности 111) прь.меняют вргинилвргинил-метокси. на 4 ьталамид. 59,5 г упомянутого соединения добавляют к 50 мл воды и смешивают с равным объемом трис-хлористс водородного буфера в виде О, 2 М раствора для образо вания субстрат буферного раствора.515471 20 5Для определения трипсина и подобных1трипсину энзимов, таких как катепсин Ви подобного трипсину энзима, найденногов веществе головок сперматозоидов, находяшихся Ь сперме, применяют. карбобензокси.диглицил 1, вргинид 4 метокси 2- нафтиламид. Для определения концентрации катепсина В 1 к 50 мл воды добавляют такое ксьличество упомянутого амида, чтобы получить 2,0 М раствор, и смешивают с равнымобъемом 2, 0 М раствора натрийквкодилат ного буфера, рН 4,8, содержащего 2 меркаптаэтанол, для получения субстрат буферного раствора. Вследствие изменения величины водородного показателя этогораствора до 6,7 его можно применить дляопределения концентрации энзима, подобноготрипсину, найденному в выделениях зеренклеток,Для определения концентрации трипсинак 50 мл воды добавляют такое количествоупомянутого амида,1 чтобы получить 2,0мМ раствор, который смешивают с равнымобъемом 0,2 М"трис-буфера при рН 7 дляпоручения субстрат-буферного раствора. Дляоблегчения растворения амида к 50 мл водыможно добавить пропиленгликоль,6формула изобретения Способ количественного определения 5 энзимов гидролитического действия добавлением к пробе анализируемого веществасубстратмбуферного раствора, инкубированиемполученной смеси с последующим введениемв полученный раствор средства, образующего 10 краситель, фотометрированием и определением энзима по калибровочному графику,отличающийся тем,что,сцелью повышения точности определения, вкачестве субстратов гидролитического дейст 15 вия энзимов используют К -аминокислстныепроизводные 4 метокси 2 нафтиламида общейформулы где Я содержитпо меньшей мере, однугруппировку аминокислоты.Составитель В.БодняРедакторО.Кузнецова Техред А.Как ышникова Корректор Н,Стель:ахФЗаказ 246/13 Изд. М й,)Тираж 1 029ПодписноеЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССРЪпо делам изобретений и.открытийМосква, 113035, Раушская наб., 4Москва, Енисейская ул., 2 "Гипроводхоз"