Устройство для препаративного электрофореза в полиакриламидном геле

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 5 С 27 2 ГОСУДАРСТВЕННЫЙПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ ИПРИ П 1 НТ СССР ОМИТЕТОТНРЫТИЯМ НИЯ ДЛЯ ПРЕПАРАТИВНО ОЛИАКРИЛАИЩНОМ ф 9ической физ рер Г. Дис Мир, 197 его Р. Н. е 1965, ч.(21) 4397858/31-2 (22) 28, 03, 88 (46) 07.03,90. Бю (71) Институт био АН СССР(57) Изобретение позволяет увеличитьнагрузку полиакриламидного геля (ПАА 1)разделяемым веществом и повысить качество разделения за счет предотвращения возникновения в ПААГ градиентотемпературы, исключения возможностимеханического смещения ПААГ во времяэлектрофореза и возникновения застойных зон в приемном канале камеры для,сбора Фракпий во время их элюирования. Для этого электрофоретическая камера 1 снабжена спиралевидным внут ренним теплообменником 5 и охлаждающей рубашкой 6, проходящими внутри камеры 1 трубками 7 для пропускания элюирующего растворителя, продольным приемным каналом 11 в съемной каме 1548740ре 4 для сбора фракций и электромагнитным смесителем, противостоящиеэлектромагниты 9 которого укреплены5на уровне канала 11, а находящийсяв этом канале перемешивающий элемент1 О совершает челночные передвиженияпо всей длине канала 11. 1 з,п. ф-лы,3 ип, Изобретение относится к препараивной лабораторной технике, в частности к устройствам для электройорезагеле, и может быть использовано дляйроведе ния п репа ративных работ, св я:анных, например, с тонкой химическоййли биологической технологией, с задачами экспериментальной и клинической гематологии для решения проблем,возникающих при получении кровезаменителей.Цель изобретения - улучшение эффективности препаративного электрофо 1 еза, повышение качества разделенияи производительности Фореза путемПредотвращения возникновения в гелеградиентов температуры.На фиг,1.изображено устройство длягРепаративного электрофореза; нафиг,2 - результаты двух режимов злюсии; на фиг.3 - результаты аналитиеского электрофореза,Предлагемое устройство представ 1 яет собой цилиндрическую вертикальную изготовленную из минерального с 1 текла элекФрофоретическую камеру 1, цомещенную между верхней 2 и нижней 3 электродными ваннами. Камера 1 соединена со съемной камерой 4 для сбоРа фракций. Камера 1 снабжена витым (в виде спирали) внутренним теплообменником 5 и охлаждающей рубашкой 6, а также проходящими внутри камеры 1 трубками 7 для пропускания элюирующего растворителя и изогнутой трубкой 8. Камера 1 выполнена из двух соединяющихся друг с другом нормальным шлифом частей, причем в верхнюю (съемную) часть вмонтированы 1 внутренний теплообменник 5 и трубки 7, вводимые во внутреннее пространство нижней (стационарной) части, снабженной охлаждающей рубашкой 6. Устройство снабжено электромагнитным смесителем, состоящим из двухпротивостоящих электромагнитов 9, установленных на уровне камеры 4, перемешиваюшего элемента 10 в виде Жерро 2 О магнитного стержня в стеклянной оболочке, свободно расположенного в образуемом при полимеризации геля в камере 1 продольном узком приемном ка-,нале 11 камеры 4, и расположенных внеустройства муль тивиб ратора и блокаэлектропитания (не обозначены)Верхняя 2 и нижняя 3 электродныеванны снабжены платиновыми электродами 12, заключенными в стеклянную оболочку с перфорациями, охлаждающимирубашками 13 и коаксиально располо -женными внутренними витыми (в видеспирали) теплообменниками 14. Камера4 снабжена полупроницземой мембраной5. Верхняя электродная ванна снабжена сливным штуиером 16.Предлагемое устройство работаетследующим об ра зом.Соединяют верхнюю и нижнюю части 4 О камеРы 1 друг с ДРУгом. Нижнее отверстие камеры 4 закрывают полупронипаемой мембраной 5 (например, целлофаном), которая служит дном камеры 4.На внутреннюю поверхность дна камеры4 укладывают шаблон из органическогостекла ( 25 3,0 к 2,О мм), располагаяего по диаметру закрытого мембранойнижнего отверстия камеры 4. Камеру 4закрепляют на нижней части камерытак, чтобы упомянутый шаблон находился в одной плоскости с обеими трубкамн 7. Одну из трубок 7 закрывают наглухо, а по другой через присоединенный к ее верхней части резиновый 55шланг на дно камеры 4 ввоцят 10-14 млбуферного раствора, служащего растворителем при п ригьто влек ии смеси акриламида и М,И -метилен "бис-акриламида (смесь мономеров) . Затем через тот5 15487же шланг под слой введенного бугьерно-.го раствора вводят смесь мономеров,содержащую персульАат аммония, ТЕМЕ 0и сахарозу, Сначала вводят 1 07-нуясмесь моцомеров, содержащую О,1 Е сахарозы до нужного уровня в камере.Затем под столб 1 07-ной смеси мономеров вводят 307-ную смесь мономеров,содержащую 0,27 сахарозы, чтобы эта 1 Опорция ( 5 мл) слегка покрыла верхнююповерхность помещенного в камеру 4шаблона.Заполнение камеры 4 и камеры 1производят так, чтобы поверхность 15раздела между вводимыми растворамисохранилась интактной вплоть до заполнения камеры 1 до нужного уровня,Заполнив камеру 1, ее оставляют ввертикальном положении вплоть до эавершения полимеризации геля. Послеполимеразации его шланг, служащий длявведения смеси мономеров, отсоединяют от одной из трубок 7 и закрываютее. Верхний слой из буферного раствора удаляют из камеры 1, Камеру 4 снимают, отделяют от камеры 1, прочищают ее и, сполоснув дистиллированнойводой, отставляют при комнатной температуре. Трубки 7 тщательно прочищают, восстанавливая полностью ихпроходимость на всей протяженности.Из открытой лосле снятия камеры 4 поверхности нижнего конца столбца геляудаляют шаблон,40 По завершении электройореза систему протока хладагента через охлаждающие рубашки и внутренние теплообменники перекрывают. Составляющие эту систему шланги отсоединяят. Источники электропитания отключают. Удаляютнижнюю электродную ванну 3. Отделяют верхнюю электродную ванну 2 от электрофоретической камеры . Из трубок 7 и 8 извлекают полиэтиленовые гланги. Отсоединяют камеру для сбора йракций 4 от электрофоретической камеры 1. Освобождают камеру 4 от полупронипаеОстающуюся в геле после извлечения шаблона канавку обрабатывают скальпелем, углубляясь на ь.1,0-1,5 мм. В канавку вкладьвают ферромагнитньпл стержень 1 О в стеклянной оболочке. Заполняют канавку элюирующим растворителем, Выходные отверстия нижней части трубок 7 должны быть свободными и должны сообщать трубки 7 с полос тью канавки без каких-,либо препятствий, Камеру 4 вновь соединяют с ниж - ней частью камеры 1, При этом канавка в геле превращается в продольньй узкий приемньй канал 11 со свободно расположенным в нем перемешивающим элементом 1 О, Подключают противостоящие на уровне дна камеры 4 электромагниты 9 и проверяют подвижность перемешивающего элемента 1 0 в канале 11: элемент 1 0 должен при этом совершать челночные передвижения по всей длине канала 11.Верхнюю электродную ванну 2 соединяют с камерой 1. Через шланг в трубке 8 в камеру вводят порцию электродного буферцого раствора так, чтобы этот раствор це вытекал из трубки 8, после чего на верхнюю поверхность столба геля под слой введенного буферного раствора вводят раствор подвергаемого разделению образца, содержащий сахарозу (0,17). Трубку 8 вместе с введенным в нее полиэтиленовым шлангом закрывают. Электродную ванну 2, закрыв штуцер 16, осторожно заполняют электродным буферным раствором . Устройство закрепляют в штативе так, что камера 4 оказывается погруженной в электродньй буферньй раствор, находящийся в нижней электродной ванне 3, В трубки 7 вводят полиэтиленовые шланги так,. чтобы введенные концы шлангов были расположены в приемном канале 11 на высоте х 0,5-1,0 мм над дном камеры 4. Через один из этих шлангов в камеру 4 вводят электродный буерньй раствор, заполняя им приемньп канал 11 камеры 4, Включают систему протока хладагента через охлаждающие рубанки и внутренние теплообменники, блок электропитания (не обозначен) платиновых электродов 12 и источник электропитания (не обозначен) электромагтов 9.Контролировать ход электройоретического разделения можно путем анализа фракций непрерывной ипи прерывистой эляции содержимого приемного канала 11 камеры 4, направляя порции элюата на какой-либо регистрирующий прибор и/или на коллектор ракций, Таким же путем и в таком же режиме можно извлекать из приемного каналакамеры 4 поступающие в него индивидуальные фракции. Извлекать последние можно, кроме того, снимая камеру 4 и заменяя ее аналогичной камерой.мой мембраны 15 и перемещающего элемента 10. Заполнявший камеру 1 гель разрушают и удаляют. Все детали разобранного устройства хорошо поддают 5 ся очистке, мойке и сушке,П р и м е р, Выделение мономерного сывороточного альбумина из препаратов сывороточного альбумина человека и крупного рога того ско та, 10Препа рат сывороточного альбумина еловека окрашивали известным способом пропионовьм ярко-синим ЙЯ. Навесу (80 мг) лиофипизированного окраценного белка растворили в 1 мл элек" тродного трисглииинового буферногоствора (рН 8,8), Раствор белка, соержащий добавленную сахарову ("0,1 Х) н добавленный свободный проционовый раситель ( 0,3 мг), ввели в электро оретическую камеру 1 (Фиг,1.) диаметом 3,4 см и высотой 4,5 см, заполенную 1 ОЖ-ньм ПААГ (рН 8,3) . Еагруза геля белком - 9 мг/см . Электройогез проводили при напряжении 500 В в ечение 18 ч (сила тока 12-18 мА).В ходе электрофореза происходит еткое разделение в геле Фракций своодного мономерного и ассоциированно о свободного красителя, мономерного, 30 имерного и прочих олигомерных форм ,льбумина без каких-либо деформаций еречисленных Фракций и без каких- либо локальных нарушений их миграциигеле, которые обычно возникают ив, а неравномерности охлаждения геля и орчирования в нем градиентов темпеатур Электрофорез при использоваии предлагаемого устройства можно рерывать на 8-10 ч, отключая устрой ство от источника электропитания. К моменту возобновления электрофореза (ам столб геля в электрофоретической Камере и разделенные в нем Фракции с 1 охраняли свое положение практически 45 без изменений,Извлечение фракций из камеры для сбора Фракций 4 (фиг,1) производили в режиме непрерывной элюцни с включенной или выключенной электромагнит ной мешалкой, начиная элюпию через.10 ч после начала Фореза. Результаты, Полученные при указанных двух режимахэлюции, представлены на Фиг.2.На Фиг,2 видно, что элюция Фракий из камеры для их сбора при выключенной электромагнитной мешалке не дает четкого разделения элюируемых фракций за счет возникновения в приемном канале 1 камеры 4 (Фиг.1) застойных зон и сорбции Фракций на внутренних стенках канала. Включение электромагнитной мешалки и связанное сэтим интенсивное постоянное перемещивание содержимого приемного канала 11резко и значительно повыцает качестворазделения элюируемых Фракций и несколько повышает их количественныйвыход за счет устранения застойныхзон в канале и сорбпии белков на егостенках,Извлеченную из приемного канала 11каме ры 4 для сбо ра Фрак ций (Фиг. 1 )Фракцию мономерного альбумина подвергалии аналитическому элек троЬо ревув ПААГ в микроэлектрофоретической камере с последующей окраской геля кумасси-синим С.Результаты аналитического электроФореза представлены на Ьиг.З. Изфиг.З видно, что с помощью предлагаемого устройства для препаративногоэлектрофореза в ПААГ удалось получитьфракцию мономерного альбумина, полностью освобожденную от димерной ипрочих олигомерных форм белка (дорожки 17-20), находящихся в исходном интактном белковом препарате (дорожки21 -23), Выход мономерного белка составлял 68 мг,Аналогичные результаты получилитакже при использовании предлагаемого устройства для электрофореза неокрашенного сывороточного альбуминачелока, окрашенного порционовым яркосиним КЯ сывороточного альбуминаи неокрашенного сывороточного альбумина крупног о рога того ско та.1формула из 1 обретения 1, Устройство для препаративного электрофореза в полиакриламидном геле, содержащее помещенную между двумя электродными ваннами цилиндрическую вертикальную электрофоретическую камеру со столбом геля, внутренним теплообменником и охлаждающей рубашкой, камеру для сбора фракций и источник постоянного тока, о т л и - ч а ю щ е е с я тем, что, с целью повышения производительности работь устройства, повышения качества разделения в геле при сохранении высокого качества разделения конечных продуктов, электрофоретическая камера дополнительно снабжена трубками длястворителя,выполнены отлив5внешний реннего пропускания элюируищего равнутренние теплообменникив виде спирали.2, Устройство по п 1,ч а ю щ е е с я тем, чтодиаметр витка спирали внут теплообменника электройоретическойкамеры составляет 0,71 -0,73, диаметртеплообменника 0,13-0,15 ее диаметра,а расстояние между его витками составляет 0,14-0,1 6 высоты находящегося в ней столба геля.1548740О 13 И И Р 1 РГ ЛСоставитель И.РогальРедактор В.Данко Техред М.Ходанич Корректор Л.БескидЗаказ 139 Тираж 506 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 101