Способ получения живой брюшнотифозной вакцины

пп 492094 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Союз Советских Социалистических Республик(51) М. 22) Заявлено 16.08.71 (21) 1694985/28-13 23) Приоритет 29.04.71 (32) 6319/7 31) (33) Швейцари Государственный коми Министров ССС Совпо(53) УДК 615.371(088,8 5.11.75. Бюллетеньпчбликова лам нзобретении открытий ата опубликования описания 17.02.7(72) Автор изобретени Иностр Рене Гер(Швейц Иностранн Швейцаришес Серум - унд им Экфоршунг дер инфеанецманиеария) явитель 54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЖИВОИ БРЮШВАКЦИНЫ фОЗН Изобретение относитской промышленности яновой вакцины.Известен способ получения живой брюшнотифозной вакцины путем выращивания стрептомицин-зависимого штамма Яа 1 гпопе 11 а урЫв питательной среде со стрептомицином, отделении культуры и лиофилизации в защитнойсреде. Однако известная вакцина обладаетнедостаточной иммуногенной активностью, 10С целью получения высокоиммуногеннойвакцины предлагают использовать в качествевакционного штамма мутант Ьа 1 гпопе 11 а 1 урЫ,обладающий блоком у ридинфосфатгалактоза 4-эпимеразы и пониженной галактокиназной 15и галакто-фосфатуридилтрансферазной активностью,Вакцина для предотвращения тифозных инФекций содержит живые, устойчивые эпимеразиоотрицательные мутанты вирулентных 20штаммов Яа 1 гпопе 11 а урЫ, являющихся эпимеразо-отрицательными мутантами Ьа 1 гпопе 11 а 1 урЫ, обладающих блоком уридинфосфатгалактоза-эпимеразы и пониженной галактокиназной и галакто-фосфатуридилтрансфе.разной активностью,Селекцию эпимеразо-отрицательных мутаная фирмапфинститут унд Институт цукционскранкхайтенария) тов осуществляют таким образом, что культуру Яагпопе 1 а 1 урЫ после мутангенной обработки заражают эп 1 оой специфическими фагами. Для этих фагов эпимеразо-отрицательные мутанты Ьа 1 гпопе 11 а урЫ являются резистентными, в то время как нормальные, вирулентные згпооФ-бактерии лизируются этими фагами. Таким образом достигается предварительная селекция эпимеразо-отрицательных гоцдт-мутантов, что облегчает их изолирование. В качестве эгпоой-специфических фагов используют фагп типа 1 0-1.Вакцину получают выращиванием селекционированных бактерий и их переработкой в вакцину, которая заключается в отделении бактерий от питательной среды и лиофилизации бактериальной суспензии в защитной среде.Новая оральная тифозная вакцина из жи. вых бактерий обладает высовой иммунизирующей активностью, малой вирулентностью и устойчивостью к реверсии в дикую форму.Мышам подкожно вводят по 10 живых микробов нового полученного штамма для вакцины, который называется Ту ЬВ.Для сравнения другим мышам вводят 10 живых бактерий вирулентного штамма Ту 2 и3через 10 дней ту же дозу 10 неактивированных путем часового нагревания до 58 С микробов того же штамма, как усилители.Определение числа бактерий в печени и селезенке этих животных показали, что аттенюированные бактерии штамма вакцины были элиминированы полностью уже по истечении 20 дней, в то время как бактерии вирулентного штамма, несмотря на меньшую дозу даже по истечении 4 недель были налицо у мышей в концентрациях 10 - 10.Через 6 недель после прививки мышам внутрибрюшинно ввели 10 живых бактерий вирулентного штамма Ту 2. В этот момент все животные были свободны от вакцинных бактерий, Путем определения числа бактерий в печени и селезенке мышей наблюдают за развитием бактерий возбудителей.Преимущества живой вакцины из эпимиразо-отрицательных мутантов заключаются в том, что одной оральной дачей можно добиться надежного, чрезвычайно сильного, специфического иммунитета против патогенных для человека Яа 1 гпопе 11 а 1 урИ.Вирулентный штамм Яа 1 топе 11 а 1 урЫ выращивают в 30 мл Вга 1 п Неаг 1 1 п 11 з 1 оп (РИсо) в качалочной колбе емкостью 100 мл при 37 С. По истечении 4 ч отделяют центрифугированием клетки бактерий и суспендируют их в физиологическом растворе хлористого натрия таким образом, чтобы суспензия содержала 10 з организмов на 1 мл. Эту суспензию облучают УФ-светом до тех пор, пока не будет достигнуто 80 -ное умерщвление бактерий. Клеткам бактерий затем повторно прививают свежую Вга 1 п Неаг 11 п 11 з 1 оп (1 Исо) и их инкубируют при 37 С на качалке, Через 2 ч культуру заражают зтоой-специфическими бактериофагами типа 1.С(1 бактериофаг/10 клеток бактерий) и инкубируют еще в течение 3 ч. Такой обработкой лизируются все зтоойбактерии и остаются только гоцци-бактерии, которые распределяют на агаровую питательную среду и инкубируют в течение 14 ч при 37 С. Образовавшиеся колонии затем реплицируют на эндо-агар, который вместо лактозы содержит 0,2 галактозы, На этой питательной среде можно легко узнать эпимиразо-отрицательные мутанты благодаря их виду роста в колониях: эпимиразо-отрицательные мутанты в противоположность дикому типу не сбраживают галактозу, и они растут в типичных бесцветных, плоских колониях с узким внешним валом и вогнутым центром, состоящим из лизированных клеток, Изолируют 30 из вышеупомянутых колоний и из них те делеционные мутанты, которые и после мутагенпой обработки Х-метил-И-нитро-К-нитрозогуанидином Хб) не показывают реверсии.Для этой цели изолированные мутанты выращивают на Вга 1 п Неаг 1 1 п 11 з 1 оп, через 6 ч обрабатывают Иб с тем, чтобы получить 99 7 ю -ное умерщвление.Оставшиеся в живых клетки после двухкратного отделения центрифугированием и 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4промывки в Бга 1 п Неаг 1 1 п 11 з 1 оп суспендируют, инкубируют на качалке при 37 С и по истечении 2 ч распределяют на свежую Вга 1 п Неаг 1 1 п 11 з 1 оп, к которой добавили 0,1 галактозы.Из-за дефекта в энзиме ИДР-галактоза- эпимераза эпимеразо-отрицательные мутанты не в состоянии метаболизировать поглощенную галактозу. Происходит накопление галактоза-фосфата и ИДР-галактозы, вследствие чего по истечении 3 - 4 ч происходит полный лизис эпимеразо-отрицательных бактерий. Зачем еще в течение 3 ч инкубируют культуру, что способствует возникновению редких ревертантов. Оставшиеся в живых бактерии распределяют на содержащий галактозу эндоагар и инкубируют в течение 14 ч при 37 С. Ревертанты можно легко узнать на этой питательной среде в виде сбраживающих галактозу темно-красных колоний.Окончательно селекционированный мутант выращивают в Вга 1 п Неаг 1 1 п 11 з 1 оп на качалке при 37 С. По истечение 6 ч бактерии отделяют центр ифугировани ем в охлаждающей центрифуге без промывки в защитной среде, состоящей из 8 сахарозы, 1,5 желатины и 5/с порошка из снятого молока, суспендированной в 1 мл этой суспензии из бактерий, лиофилизируют в ампулы емкостью 5 мл.Лиоампулу полученного нового вакуумного штамма открывают и штамм выращивают на питательной среде из скошенного агара при 37 С. Бактерии получают с поверхности скошенной агарной культуры и их суспендируют в физиологическом растворе хлористого натрия. Эту суспензию из клеток прививают содержанию колбы Эрлен мейера емкостью 1 л. Колба содержит 600 мл питательной среды, которую получают путем растворения 28 г казеингидролизата, 10 г дрожжевого экстракта и 2 г глюкозы в 1 л дистиллированной воды и значении рН 7,2, который получают посредством 1 н, раствора ХаОН. Колбу Эрленмейера в течение 6 ч встряхивают при 37 С, Полученную бактериальную культуру распределяют на 25 л полученной среды. Культуру инкубируют в течение 12 ч при 37 С, проветривая ее (5 л воздуха/мин). Рост предварительной культуры и главной культуры определяют нефелометрическим путем, Культурными пробами определяют чистоту. По истечении времени культивирования клетки бактерий отделяют центрифугированием в охлаждаемой центрифуге без промывки, суспендируют в 600 мл защитной среды и порциями по 1 мл лиофилизируют в 5 мл ампулы или в прокалываемые пузырьки, Применяют ее следующим образом: ампулы или прокалываемые бутылки открывают, содержание сус. пендируют в 3 - 5 мл холодной или тепловатой воды или молока и дают через рот.Формула изобретенияСпособ получения живой брюшнотифозной вакцины путем выращивания вирулентного492094 Составитель С. МалютинаРедактор Л. Новожилова Техред Е. Подурушина Корректор Т. Добровольская Заказ 105/18 Изд. М 1972 Тираж 529 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 45Типография, пр. Сапунова, 2 штамма Яа 1 гпопе 11 а 1 урЫ, отделения культуры и ее лиофилизации в защитной среде, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью получения высокоиммуногенной вакцины, используют в качестве вакцинного штамма мутант Ьа 1 п 1 опе 1 а 1 урЫ, обладающий блоком уридинфосфатгалактоза-эпимеразы и пониженной галактокиназной и галакто - 1 - фосфатуридилтрансферазной активностью.5