Способ получения о-дифенолоксидазы

О П И С А Н И Е (1 ц 436854ИЗОБРЕТЕН ИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ СОюз Советских Социалистических Республик. С 12 д 1310 2) Заявлено 04,0 исоединением заявкиГасударственный комитет Совета Министров СССР оо делам изобретений и открытий(71) Заявитель НОЛОКСИДАЗЫ 54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ О о материала эксграром при значениях щим аскорбат натрия,1Изобретение относится к ферментной промышленности, точнее к способу получения о-дифенолоксидазы, играющей важную роль в метаболизме клетки чайного растения, а также в формировании таких качественных показателей чая, как вкус, цвет настоя и частично аромат.Известен способ получения о-дифенолоксидазы, предусматривающий измельчение сырья, экстракцию фермента, удаление из экстракта нерастворимых частиц, например, фильтрацией, осаждение фермента, например сульфатом аммония, отделение полученного осадка, например, центрифугированием, растворение осадка в буферном растворе, пропуск раствора через ионообменники и элюцию фермента с ионообменника.Предлагаемый способ позволяет получить изоферменты о-дифенолоксидазы из чайного растения.Достигается это тем, что из измельченного сырья удаляют фенольные вещества, экстракцию фермента осуществляют буферным раствором, содержащим аскорбат натрия, теграборат натрия и хлористый натрий, рН не ниже 6,0.Для экстракции фермента в качестве буферного раствора используют глицинатный буфер при значениях рН 9,0, в котором содержание аскорбата натрия, тетрабората натрия и хлористого натрия соответственно составляют (в молях): 0,03; 0,05 и 1,0, а для растворения осадка в качестве буферного раствораиспользуют 0,1 М цитратный буфер при рН5 не ниже 5,0. При этом элюцию фермента сионообменника целесообразно осуществлятьбуферным раствором с ионной силой 0,5, аосаждение фермента - из экстракта или сульфатом аммония при 100%-ном насыщении,10 или ацетоном при соотношении 1: 4.Для получения гомогенных изоферментово-дифенолоксидазы элюаты дополнительнохроматографируют на колонках с гидрок:илаппатитом и амберлитом, а жидкую фазу, по 15 лученную после отделения осадка ферменга,можно использовать для выделения танинокатехинового комплекса,П р и м е р 1. Сырье (чайный лист) измельчают в замороженном виде до максимального20 разрушения клеток, а затем удаляют фенольные пигменты, смолы и другие вещества путем осаждения 80%-ным ацетоном (соотношение чая к ацетону 1: 4) или экстракцией измельченного сырья поликапролактамовым по 25 рошком (капроном) в количестве 2 г на 1 гсырья в зависимости от содержания фенольных веществ в материале.Белки из обработанноггируют буферным раство30 рН 6,0 и выше, содержа436854 Составитель М, ЛаринаТекред 3. Тараненко Корректор А. Дзесова Редактор А, Бер заказ 3460/9 Изд. Мз 85 Тираж 456 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий Москва, Ж, Раушская наб., д. 45Сапунова, 2 Типография, пр. гетраборат натрия и хлористый натрий, например глицинатным буфером при рН 9,0, содержащим 0,03 моль аскорбата натрия,0,05 моль тетрабората натрия и 1,0 моль хлористого натрия.Полученный ферментный раствор отделяютот нерастворимых частей центрифугированиемили фильтрацией. Из раствора полностью выделяют альбумины, глобулины и другие белки.путем осаждения их сернокислым аммонием(100-ное насыщение), ацетоном или другимосадителем, существенно не влияющим на активность о-дифенолоксидазы.Таким образом получают суммарный препарат ферментных белков.Затем осадок гомогенизируют буферным раствором при рН 5,0 и выше, например 0,1 Мцитратным буфером при значениях рН 6,0.Элюирование проводят в течение времени, необходимого для полного извлечения о-дифенолоксидазы, например до 5 мин.ферментный раствор отделяют центрифугированием и обессоливают.Для разделения и получения отдельных изоферментов выделенный суммарный препарато-дифенолоксидазы хроматографируют на колонках с ионообменником КМ - целлюлозойили ДЭАЭ - целлюлозой. Элюцию изоферментов осуществляют с увеличением ионой силыбуфера до 0,5. Градиент ионой силы устанавливают добавлением к буферному растворухлористого натрия. В результате получают довосьми изоферментов о-дифенолоксидазы. Ихобессоливают и сушат одним из известныхспособов, например лиофилизацией,Для получения томогенных изоферментово-дифенолоксидазы их дополнительно хроматографируют на колонках с гидроксилаппатитом и амберлитом.С целью рационального использованиясырья из того же исходного материала выделяют танино-катехиновый комплекс (витамин Р), отдельные катехины и кофеин, Дляэтого из полученной ацетоновой вытяжки перегоняют ацетон, а из остатка выделяют танино-катехиновый комплекс, отдельные катехины и кофеин одним из известных способов.П р и м е р 2. Сырье измельчают в замороженном виде до максимального разрушенияклеток и затем экстрагируют из него белки ифенольные вещества буферным раствором прирН 6,0 и выше, содержащим аскорбат натрия,тетраборат натрия и хлористый натрий, например глицинатным буфером при рН 9,0, содержащим 0,03 моль аскорбата натрия,0,05 моль тетрабората натрия и 1,0 моль хлористого натрия, ферментный раствор отделяютот осадка центрифугированием или фильтра 10 15 20 25 Зо 35 40 45 50 55 цией. Для удаления фенольных веществ раствор пропускают через колонку с сафадексом Гили Г, а белки из раствора осаждают ацетоном (соотношение раствора к ацетону 1: 4) или другими осадителями, существенно не влияющими на активность о-дифенолоксидазы. Последующие операции проводят аналогично примеру 1. Предмет изобретения1. Способ получения о-дифенолоксидазы, предусматривающий измельчение сырья, экстракцию фермента, удаление из экстракта нерастворимых частиц, например, фильтрацией, осаждение фермента, например, сульфатом аммония, отделение полученного осадка, например, центр ифугированием, растворение осадка в буферном растворе, пропуск раствора через ионообменники и элюцию фермента с ионообменника, отличающийся тем, что, с целью получения изоферментов о-дифенолоксидазы из чайного растения, из измельченного сырья удаляют фенольные вещества, экстракцию фермента осуществляют буферным раствором, содержащим аскорбат натрия, гетраборат натрия и хлористый натрий, рН не ниже 6,0.2. Способ ио п. 1, отличающийся тем, что в качестве буферного раствора для экстракции фермента используют глицинатный буфер при рН 9,0, в котором содержание аскорбата натрия, тетрабората натрия и хлористого натрия соответственно составляет (в молях) 0,03; 0,05 и 1,0.3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для растворения осадка в качестве буферного раствора используют 0,1 М цитратный буфер, рН не ниже 5,0.4. Способ по и. 1 - 3, отличающийся тем, что элюцию фермента с ионообменника осуществляют буферным раствором с ионной силой 0,5.5, Способ по и. 1, отличающийся тем, что осаждение фермента осуществляют из экстракта сульфатом аммония при 100 о/о-ном насыщении.6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что осаждение фермента осуществляют из экстракта ацетоном при соотношении 1: 4.7. Способ по п, 1 - 4, отличающийся тем, что, с целью получения гомогенных изоферментов о-дифенолоксидазы, элюаты дополнительно хроматографируют на колонках с гидроксилапиатитом и амберлитом.8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что жидкую фазу, полученную после отделения осадка фермента, используют для выделения танино-катехинового комплекса.