Способ получения интерферона

Союз Советскии Социалистическии РеспубиинОП ИСАНИЕИЗОБРЕТЕН ИЯ К АВТОРСКОМУ СЬИДВТЕЛЬСТВУЗаявлено 2 6,02. 70 (21)1406708/31-1 0 с присоединением ааяокиГеоударотввиим квинтет. Соавтв Минивтров СССРио,авлам иаобрвтвиийн открытий иоритет иковаио 25.12.77. Бюллетень Ь 47) Дата опубликования описания 24.12.7 2) Авторы изобретен В, Д. Соловьев, В, П. Кузнецов и В,енко) Заявитель Институт эп иологи 54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНТЕРфЕРОН О ния - поонцентриро кс2 длагакойМ 199 25 Изобретение относится г области медицины, точнее к способам получения медицинских препаратов, а именно ннтерферона.Известен способ получения интерферонапутем воздеФ:твин на лейкоциты, выделенные иэ донорской крови и взвешенные в питательной среде, вирусом - интерфероногеном с последующим удалением лейкоцитов,нейтрализацией вируса-ннтерфероногена,очисткой и лиофильным высушиванием.Однако известный способ не обеспечяРеет получения препарата с достаточноконцентрированной активностью.Цель предлагаемого изобретевышение качества препарата и кванне его активности,Для этого интерферонсодержащую культуральную жидкость пропускают через молекулярные разделители, например, СефадеГгрубый",Для получения интерферона по преемому способу выделенные иэ донорскрови лейкоциты взвешивают всреде(10- лейкоцитов на 1 мл среды), содежащей 100 ед/мл пеницилина 50 ед/мл нкробиологии им. Н. ф, Гамале стрептомицина и 10 ед/мл гепарина, переносят в стерильные матрицы иэ нейтрального стекла и добавляют 5 % плазмы или сыво ротки крови человека. В качестве вируса-ииь терфероногена используют вакцинный штамм Н вируса болезни Ньюкасла в количестве 10-100 ТЦД на лейкоцит или 10-20 гемагглютинирующнх единиц на 10 лейко цитов. Вирус вводят в среду с лейкоцитамиои инкубнруют взвесь 3 ч при 37 С в стационарном горизонтальном положении. Затем лейкоциты отделяют центрнфугированием при 1250 Д в течение 15 мин. Осадок лейкоцитов ресуспендируют в свежей порциа среды Ж 199 (10 лейкоцитов на 1 мл среды)содержащей укаэанное выше количество антибиотиков и гепарина, добавляют 5-10% плазмы или сыворотки крови, переносят в матрацы и ннкубируют в тех жв условиях 28-20 ч. По окончании инкубацня клетки отделяют центрифугированием при 1500-2000 в течение 15 мин, осадок отбрасывают, а надосадочную жидкость повторно центрнфугируюг. К очищенной жили- кости добавляют 10-20%-ный раствор со297296 55 3линой кислоты до р 11 2,2-2,4 и выдержиоввюг не менее 4-5 суток при 4 С, после чего огбирают образцы для контроля сгерильности, токсичности и акгивееостее,Стерильность контролируют высевом 1 мл раствора на бульон с тиогликоллатом и бульон .Сабуро. После 10 суток инкубации1 обульонвРс тиогликоллвгом при 37 С и, обульона Сабуро при 20 С посевы до,.жны оставаться стерильными. Вирусологическую стерильность определяют введением по 0,2 мл же" дкости в пробирки с 3-суточной культурой куриных фибробластов. Через 3-4 суток при наблюдении под микроскопом в мо ослое клеток не должно быть признаков цигоплагического действия. Дополнительный контроль проводят путем введения 0,2 мл жидкости в вллангоисную полость 9-10-дневных куриных эмбеионов; через 3 суток инкубациивпри 37 С не еолжно быть гибели эмбрионов и отобранная из них аллантоисная жидкость не должна содержать гемагглютининов петушиных эритроцитов, Прогивовирусную активность раствора определяют по задержке цитопатического действия вируса возикуляр ного стоматита (вакцинный штамм "Индиана, взятого в дозе 100 Т 1.1 Ц 5 в культуре клеток первично-грипсинизированной кожно-мышечной ткани 10-12 недельных эмбрионов человека или в перевиваемой 30 культуре диплоидных клеток кожно-мышечной ткани эмбрионов человека. Титр прогивовирусной активности должен составлять не ме нее 32 ед/мл в культуре фибропласгов и не менее 250 ед/мл в культуре диплоидных 3 клеток. Определение токсичности проводят в монослойной культуре клеток кожно-мы-: шечной ткани эмбрионов человека, В культуру со сформированным монослоем вводят 1 мл разведения 1:16 (первично-трипсини зированная культура ) или 1:100 (диплоиднвя культура) в среде с гидролизатом лактальбумина, 14 199 или Игла, Через 2-3осуток инкубации при 37 С не должно1быть никаких признаков дегенерации моно слоя и морфология клеток должна оставаться неизменной,ееля концеигрирования активности проверенную иитерферонсодержашую кульгурвльную жидкость через систему сифонов под 50 давлением в условиях стерильности и герметичности подают в колонку, заполненную заранее подготовленным молекулярным разделителем Сефвдекс Г"грубый, При диаметре колонки 60 1 мм и высоте2000 мм за один цикл очистки можнопропустить 3 л жидкости, Элюирование проводят стерильной дистиллированной водой.Сначала на выходе появляегся активная белковая фракция, регистрируемая по жел- М Гоив го-к Ори чне еией 011 яееес еееиеии расге 3 орвили -с помощью прогочиого деисиметра,После прекращения опалесиеииии отбор белковой фракции иренрашвюг, Элювг контролируют на бактериологическую стерильностьи нв полноту очистки ог иизкомолекулярныхвеществ. Последнюю проверяют пробой нафеноловый красный, который ирисутсгвуегв исходной жидкости и должен целикомоставаться во фракции низкомолекулярныхвеществ (при подецелвчивании пробы белковойфракции не должно отмечаться покраснения,раствора), Провереиныи элюат разливаютв стерильные ампулы и звмораживаюг 1 еериц , о,гемператуГе -40 С, Затем из ампул откачивают воздух и подогревают до температуоры не выше 30-35 С в течение 48-72 ч.После высушивания ампулы звнаивают подвакуумом. Остаточная влажность не должнапревышать 4%. Готовую продукцию вновьконтролируют на бактериологическую и вирусологическую стерильность, токсичность,а также безвредность путем внугрибрюшинного введения е-белым мышам весом10-12 г по 0,5 мл раствора препарата.При наблюдении в течение 5 суток мышидолжны оставаться здоровыми. Кроме тогоконтролируют физические свойства, растворимость и остаточную влажность препарата.Для подготовки геля Сефвдекс Г грубый" необходимое количество смолызаливают 0,05-0.1% раствором повареннойсоли в дистиллированной воде и выдержиовают 2-3 суток при 4 С. Затем многократной декантацией отделяют мелкую фракцию смолы, а остаток загружают в герметично закрьеваемею колонку, Через слой геля пропускают5 объемов дистиллировве 1 ной воды, послечего в колонку вводят 5 Ъ раствор . формальдегида и оставляют на 1 сутки. Дляудаления формальдегида через гель пропускают 10 объемов стерильной дистиллированной воды, последние порции которой на выходе из колонки проверяют на стерильность,После осуществления цикла очистки культурной жидкости и элюции белковой фракцииэлюируюг низкомолекулярные вещества пропусканием 10 объемов стерильной дистиллированной воды. В случае уплотнения слоя геля и гнижения скорости фильтрования гельизвлекают иэ колонки, отделяют мелкуюфракцию и вновь подвергают вышеуказаннойобработке. формула изобретения Способ получения интерферона путем воздействия на лейкоциты, выделенные из донорской крови и взвешенные впитательнойЗакаа 4989/27 Тираж 541 Подписное ННИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытйй 113035, Москва, Ж, Раушская набд. 4/5филиал ППП "Патент, г, Ужгород, ул, Проектная, 4 среде вирусом-интерферогеном с пос" епувцимудалением лейкоци гое, п.йгралиэапией вируса-ннгерферогена, очисгкой н лиофильнымвысугпиванием продукта, о г л и ч а юа и й с я темиго, с целью повииения качесгва препарага и конценгрирования в оактивности, интерферопсолержшпую культуральную жидкость пропускакгг нерея молекулярные разделителинапример, СефапексГ"грубый"