Способ культивирования бактерий вида bacillus аnтнrасis

(51) 5 АНИЕ И БР Т К У СВИДЕТЕЛЬСТВ ВИРОВАНИЯ БАЙТНЯАС 13кробиология, кя форма бакбирская язва,54) СПОСОБ КУЛЬТИ ИЙ ВИДА ВАС 1 ОЯ 57) Использование: м ирование, спорова асцз апйгас 1 з, си КТЕьтирий ита ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНО(71) Всесоюзный научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии(72) И,А.Бакулов, В.А,Гаврилов, А,Е.Лавре 1 сюк и Л,Ф.Николайчук56) ГОСТ 15 - 991 - 71. Вакцина СТИ живая ,против сибирской язвы животных,Авторское свидетельство СССР М 1809556, кл. А 61 К 39/00, 1987. Изобретение относится к микробиологии, в частности к способам изготовления пор.ВасПцз апйгас 1 з, и может быть исрользовано в научно-исследовательских учреждениях, занимающихся изучением (1 ибирской язвы, а также в биологической промышленности при изготовлении протиЦосибиреяэвенных вакцин,Целью изобретения является увеличеие уровня спорообразования и выхода бисмассы спор штаммов Вас 1 цз апйгасз, уменьшение времени изготовления, сниже 11 ие себестоимости и трудозатрат на производство целевого продукта.Цель достигается тем, что при изготов 11 ении споровой формы штаммов Васцз 4 пйгас 1 з используют вместо КПА новую 6 поруляционную среду, содержащую сухой тельная среда, вакцина против сибирскои язвы. Сущность изобретения: для изготовления споровой формы культивирование бактерий проводят в течение 16 - 18 ч при 34-35 С, затем в течение 56 - 64 ч при 28 - 30 С на питательной среде, содержащей в качестве источника азота гидролизат кормовых дрожжей с содержанием общего азота 1,2 - 1,5;ь, аминного азота 0,5 - 0,7 оуь и дополнительно агар, хлористый натрий, фосфорнокислый одноэамещенный калий, фосфорнокислый двузамещенный калий, щавелевокислый натрий, твин - 80. В результате увеличивается уровень спорообразования и выход биомассы спор, уменьшается время изготовления, снижается себестоимость и трудозатраты на производство вакцины, 1 табл,гидролизат кормовых дрожжей 12-15 г/л с содержанием общего азота 1.2 - 1,5, амин- - ъ ного азота 0,5 - 0,7и дополнительно агар Со 3,5 - 40 г/л, хлористый натрий 4-6 г/л, фос- (Д форнокислый одноэамещенный калий 3 - 7 сг/л, фосфорнокислый двузамещенный калий 5-12 г/л., щавелевокислый натрий 0,8-1,2 г/л, твин0,02-0,04 оу 6, Указанное количество общего и аминного азота обеспечивает высокий уровень спорообразованив (98-99). Кроме того, культивирование )в штаммов проводят в иных условиях, а имен- а но через 16-18 ч выращивания при 34 - 35 С температуру понижают до 28-30 С и культивирование продолжают в течение 56 - 64 ч,Применение для наработки спорового материала штаммов Васцз апйгасз новой питательной среды, а также изменение40 50 условий культивирования позволяют повысить выход спор в 15-20 раэ по сравнению с прототипом, уменьшить время изготовления, снизить себестоимость и трудозатраты на производство целевого продукта без изменения биологических свойств штаммов.П р и м е р. Для изготовления спорового материала штаммов ВасИцз апйгасз применяют новую споруляционную среду, в которой в качестве источника азотсодержащих веществ используют сухой гидролизат кормовых дрожжей 12-15 г/л. Уменьшение количества гидролизата кормовых дрожжей в составе питательной среды ниже 12 г/л приводит к снижению биомассы спор, увеличение свыше 15 г/л нецелесообразно, так как не способствует повышению выхода спор, но удлиняет процесс спорообразования на 20-25 ч.Для создания нейтрального рН питательной среды(7,2 +0,2) на 1 л среды добавляют 5-12 г фосфорнокислого двуэамещенного калия и 3-7 г фосфорно- кислого однозамещенного калия, Изменение количества этих компонентов ниже ипи выше приведенных допусков вызывает сдвиг рН в кислую или щелочную сторону, что неблагоприятно сказывается на росте сибиреязвенного штамма, Добавление в среду щавелевокислого натрия (0,8 - 1,2 г/л) и таина - 80 (0,02-0,04%) способствует быстромуспорообразованию, Изменениесодержания этих веществ приводит к замедлению образования спор.Затем в питательную среду добавляют агар (3,5 - 40 г/л), стерипизуют ее автоклавированием при 120 С в течение 40 мин и разливают по 0,5 л в бутыли емкостью 2,5 л (четверти), После застывания агара бутыли со средой контролируют на стерильность, выдерживая 16-20 ч при 36-37 С.Для изготовления спор штамм ВасИцз апйгасз засевают в мясо-пептонный бульон, посевы инкубируют при 36-37 С в течение .14-16 ч. Затем бульонную культуру засевают в бутыли со споруляционной средой из расчета 4-6 мл в каждую бутыль. Посевы инкубируют при 34-35 С в течение 16-18 ч, затем температуру понижают до 28 - 30 С и культивирование продолжают в течение 56 - 64 ч,После культивирования Васиз апйгасз в описанных условиях споровую культуру отсасывают иэ бутылей в стеклянную емкость через сифон с марлевым фильтром. Затем определяют концентрацию жизнеспособных спор путем рассева на чашках Петри с предлагаемой питательной средой и последующего подсчета выросших колоний. В результате сравнительных исследований установлено, что уровень спорообразования на предлагаемой споруляционнойсреде к этому времени составляет 98-99,5 тогда как на КПА этот показатель равен 5860%, лишь на 4-5-е сутки культивированияна КПА уровень спорообразования составляет 65 и 70% соответственно. Культивирование штамма на разработанной10 питательной среде свыше 80 ч нецелесообразно, так как выход биомассы и уровеньспорообразования при этом не повышаются,Таким образом, при культивировании15 штамма на разработанной питательной среде уровень спорообраэования выше, чем наКПА в 1,8-1,9 раза. Кроме того, при выращивании на КПА часть спор находится в незрелом состоянии, а около 15-20%20 вегетативных клеток не образуют спор, тогда как на предлагаемой среде спорулируютпочти все клетки (98 - 99%).Большое значение для повышения выхода спор имеют условия культивирования.Установлено, что понижение температурыкультивирования до 28-30 С на разработанной питательной среде приводит к значительному увеличению урожая спор (в 8-12раз).30 В результате сравнительных исследований установлено, что выход спор с 1 лновой споруляционной среды прикультивировании вакцинного штамма 55 -ВНИИВВиМ в описанных условиях состав 35 пяет (60-74) 10, тогда как с такого жеколичества КПА получено (3-4) 10 спор.В таблице приведены сравнительные данные, полученные при наработке 5 серий спорового материала вакционного штамма 55 - ВНИИВВиМ в параллельных опытах на КПА и новой спорупяционной среде. Учитывая то, что одна иммунизирующая доза вакцины 7 для крупных животных составляет 210 спор, с 1 л новой споруляционной среды получено 30000-37000 доз, тогда как с 1 л КПА - 1500-2000 доз сибиреяэвенной вакцины.Таким образом, выход спор вакционного штамма 55-ВНИИВВиМ с единицы новой споруляционной среды в разработанных условиях культивирования в 15-20 раз выше, чем в прототипе.ф о р мул а изобретения Способ культивирования бактерий вида ВасИЬз апйгасз, включающий посев и инкубирование бактерий при 34-35 С на плотной споруляционной среде, содержащей источник азота, натрий хлористый, агар и воду,отличающийся тем,что,с целью1837071 ыход спор вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ с 1 л питательной сред Составитель И,бакулТехред М.Моргентал Корректор И.Шулла Р дак Заказ 2855 Тираж ВНИИПИ Государственного комитета по из 113035, Москва,Ж, РПодписноеретениям и открытиям при ГКНТ ССшская наб., 4/5 изводственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул, Гагарина, 10 овышения уровня спорообразования, выода спор и ускорения способа, инкубироание проводят в течение 16-18 ч на среде, одержащей в качестве источника азотадролизат кормовых дрожжей с содержаием общего и аминного азота 1,2-1,5 и 5-0,7 соответственно и дополнительно одержащей калий фосфорнокислый одноамещенный, калий фосфорнокислый двузамещенный, натрий щавелевокислый ивинпри следующем соотношении компонентов, г/л: гидролизат кормовых дрожжей с содержанием общего и аминного азота 1,2-1,5 и 0,5-0,76 соответственно 12-15; агар 35-40; натрий хлористый 4-6; натрий 5 щавелевокислый 0,8-1,2; калий фосфорнокислый однозамещенный 3-7; калий фосфорнокислый двузамещенный 5-12; твин0,2-0,4; вода до 1 л, далее температуру понижают до 28-30 С и дополнительно 0 инкубируют на той же среде в течение 56-64ч,