Способ выделения 4-иили 5-оксииндолил-3-уксусных кислот

(71) Институт биохимии и физроорганизмов АН СССР(56) Кощеенко К.АБаклановский А, Г Аринбасаров М.У Сгидроксилировании индоликислоты грибом Азрп 19 ег ИБФкладная биохимия и микробио13, вып. 2, с. 248-252.(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ 4 СИИ НДОЛИЛ-УКСУСН ЫХ К Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в медицинской промышленности,Цель изобретения - повышение качества целевых продуктов и упрощение способа.Поставленная цель достигается тем, что хроматографию проводят на гидрофильных анионообменных носителях перед экстракцией, при этом элюцию продуктов осуществляют 0,5 - 0.7 М йаС 1.Способ заключается в том, что раствор, содержащий смесь оксииндолилуксусных кислот, подвергают хроматографии на гидрофильном анионообменном сорбенте, используя элюцию 0,5-0,7 М г 1 аС 1, затем фракции, содержащие соответственно 4- ОН-ИУК или 5-ОН-ИУК, концентрируют в вакууме до небольшого объема, полученные концентраты подкисляют до рН 3-4 и экстрагируют целевые продукты гидрофобным органическим растворителем, например этилацетатом.5 Ц 1822885 А 1(57) Использование: биотехнология, медицинская промышленность, Сущность изобретения; раствор, содержащий смесь 4- и 5-оксииндолил-уксусных кислот, подвергают хроматографии на колонке, заполненной гидрофильным анионообменным сорбентом и элюируемой 0,5-0,7 М раствором йаС. Фракции, содержащие целевой продукт, упаривают, подкисляют до рН 3-4 и экстрагируют гидрофобным органическим растворителем, Полученные экстракты обезвоживают, упаривают и выделяют продукт с выходом 75-98 ф и содержанием основного вещества 98. Этилацетатный экстракт, содержащий 4-ОН-ИУК. обеэвоживают сульфатом натрия, упаривают под вакуумом досуха, Получают аморфный порошок белого цвета с содержанием основного вещества не ниже 98 и выходом 75 - 98 от содержания в исходном растворе.Этилацетатный экстракт, содержащий 4-ОН-ИУК, обезвоживают сульфатом натрия, упаривают под вакуумом досуха. Получают аморфный порошок белого цвета с содержанием основного вещества не ниже 98 и выходом от содержания в исходном растворе,Этилацетатный экстракт, содержащий 5-ОН-ИУК, обеэвоживают сульфатом натрия, упаривают под вакуумом до минимального объема и оставляют на холоду. Выпавшие кристаллы отфильтровывают и сушат под вакуумом. Получают белый кристаллический порошок с содержанием основного вещества не ниже 99 и выходом86-98,5 от содержания 5-ОН-ИУК в исходном растворе.Способ может быть использован для выделения и очистки 4- и 5-ОН-ИУК из растворов, их содержащих, как в индивидуальном виде, так и в смесях, в том числе из фильтратов культуральной жидкости грибов.Проведение хроматографии на гидрофильных анионообменных сорбентах в условиях элюции 0,5 - 0,7 М йаС на первом этапе очистки, а при выделении из культу- ральной жидкости грибов непосредственно после отделения биомассы, позволяет сразу четко разделить два продукта и одновременно освободиться от окрашенных примесей, что дает возможность при дальнейшей экстракции получить сразу чистый продукт, Нами было установлено, что при использовании для элюции растворов хлористого натрия с концентрацией менее 0,5 М снижается выход целевых продуктов. Увеличение концентрации йаС с 0,7 М до 1,0 М не приводит к улучшению качества разделения и увеличения выхода продуктов. Применение в качестве элюентов аммонийных солей, например ИН 4 СНЗСОО и(СН 4)2 СОз, приводило к снижению качества получаемых продуктов, появлению окрашенных примесей в процессе элюции и снижению содержания 4- и 5-ОН-ИУК в конечных препаратах.П р и м е р 1. 2 л фильтрата культуральной жидкости гриба Азрегццв идег ИБФМ Г, содержащего 0,22 г/л 5-ОН-ИУК и 0,28 г/л 4-0 Н-ИУК, пропускают через колонку 2,2 х 40 см, заполненную ДЭАЭ-сефадексом А, со скоростью 50 мл/час, Затем осуществляют элюцию целевых продуктов 0,5 М МаС с той же скоростью, Отбирают фракции по 100 мл, определяя в них содержание продуктов методом тонкослойной хроматографии и спектрофотометрически по поглощению при 280 нм. Фракции 9-13, содержащие 5-ОН-ИУК. обьединяют, упаривают в вакууме до 50 мл. Концентрат подкисляют до рН 3,5 2 М НС и 5-ОН-ИУК экстрагируют многократно этилацетатом, Экстрактобезвоживаютсульфатом натрия и упаривают досуха, Получают 400 мг кристаллического порошка белого цвета 5-ОНИУК с содержанием основного вещества 100 ф,. Выход продукта от содержания его в фильтрате составляет 98.5.Фракции 16-19, содержащие 4-0 Н-ИУК, обьединяют, упаривают в вакууме до 100 мл. Полученный концентрат подкисляют 2 М НС до рН 3,5 и экстрагируют из него 4-ОНИУК этилацетатом. Экстракт обезвоживают сульфатом натрия, упаривают в вакууме досуха. Получают 550 мг аморфного порошкаЧСФР) со скоростью 200 мл/час. Элюцию 55 ведут 0,5 М МаС со скоростью 200 мл/час,отбирая фракции по 200 мл.Фракции, содержащие 4-ОН-ИУК. очищают далее, как указано в примере 2, и получают белый аморфный порошок весом 2,0 г с содержанием основного вещества 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 белого цвета с содержанием 4-ОН-ИУК 99,8. Выход продукта от содержания его в фильтрате составляет 98.2 ь.П р и м е р 2. 1 О л фильтрата культуральной жидкости гриба Авр.п 9 ег ИБФМ Г, содержащего 0,3 г/л 5-ОН-ИУК и 0,2 г/л 4-0 Н-ИУК, пропускают со скоростью 200 мл/час через колонку (6 х 150 см), заполненную ДЭАЭ-целлюлозой, переведенной в ОН-форму и промытой водой. По окончании сорбции проводят элюцию 0,5 М чаС со скоростью 150 мл/ч, Отбирают фракции по 200 мл с помощью автоматического коллектора.Фракции, содержащие 5-ОН-ИУК (Ч=2,5 л, С=1,2 г/л) обьединяют, упаривают под вакуумом до 300 мл, доводят рН до 3,8 с помощью 2 М НС, Экстрагируют дробно (3-4 раза) этилацетатом до полного извлечения 5-ОН-ИУК из водного слоя, Этилацетатный экстракт (Ч=500 мл, С=5,4 г/л) высушивают безводным сернокислым натрием, упаривают под вакуумом до объема 8,5 мл и оставляют при 4 - 6 С в течение ночи. Выпавшие кристаллы отфильтровывают на стеклянном фильтре, промывают холодным этилацетатом и сушат в вакуум-сушильном шкафу при комнатной температуре. Получают 2,0 г белого порошка с содержанием основного вещества 99,8. Надосадочную жидкость упаривают до 2 мл и охлаждают, Выпавшие кристаллы сушат. Получают 0,7 г кристаллического порошка белого цвета с содержанием основного вещества 99,5. Суммарный выход составляет 90"-,ь от содержания 5-ОН-ИУК в фильтрате культуральной жидкости.Фракции, содержащие 4-ОН-ИУК, объединяют Ч=2,8 л, С=0,71 г/л), упаривая под вакуумом до 200 мл, подкисляют до рН 3,8, экстрагируют дробно этилацетатом, Этилацетатный экстракт (Ч=400 мл, С=3,8 г/л) высушивают безводным сульфатом натрия и упаривают под вакуумом досуха, Получают 1,5 г белого аморфного порошка с содержанием основного вещества 98,5;,. Выход составляет 75 от содержания 4-ОН-ИУК в фильтрате культуральной жидкости.П р и м е р 3. 1 О л фильтрата культуральной жидкости гриба Азр,п 9 ег ИБФМ Е, содержащей 0,25 г/л 4-ОН-ИУК и 0,25 г/л 5-ОН-ИУК, наносят на колонку (Зх 45 см) сДЭАЭ-сфероном фирма "СЬеваро",1822885 Составитель В,ЕжовТехред М.Моргентал Корректор М.Петрова Редактор Заказ 2174 Тираж ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж.35, Раушскак наб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород. ул,Гагарина, 101 98 и выходом 801 от содержания в филь- трате культуральной жидкости,Фракции, содержащие 5-0 Н-ИУК, обьединяют, подкисляют до рН 3,6 и далее очищают, как указано в примере 1. Получают 2,4 г кристаллического порошка с содержанием основного вещества 99,5 ф, и выходом 96 от содержания в фильтрате культуральной жидкости.П р и м е р 4. 10 л фильтрата культуральной жидкости гриба Аэр.п 9 ег Г, содержащего 0,2 г/л 4-ОН-ИУК и 0,3 г/л 5-0 Н-ИУК, очищают как указано в примере 3, но в качестве анионообменного сорбента используют ОАЕ-сефадекс в колонке Зх 80 см.Получают 1,6 г белого аморфного порошка 4-ОН-ИУК с содержанием основного вещества 98 и выходом 80 О от содержания в фильтрате и 2,8 г кристаллического белого порошка 5-ОН-ИУК с содержанием основного вещества 100 ф 6 и выходом 93,3 ф от содержания в фильтрате культуральной жидкости.П р и м е р 5. Способ осуществляют как в примере 2, но в качестве элюента используют 0,7 М йаС 1, Получают 2,6 г кристаллического порошка 5-ОН-ИУК с содержанием основного вещества 9975 и 1,6 г белого аморфного порошка 4-ОН-ИУК с содержанием основного вещества 98,2 ф,. Выход 5- и 4-ОН-ИУК от содержания их в фильтрате культуральной жидкости составляет соответственно 863 и 8075.П р и м е р 6, 1 л раствора, содержащего 1 г 4-ОН-ИУК и 1 г 5-0 Н-ИУК, пропускают через колонку 2,0 х 30 см, заполненную ДЭАЭ-сфероном, со скоростью 50 мл/ч. Элюцию осуществляют 0,5 М МаС 1. Фракции, содержащие 5-0 Н-ИУК, обьединяют, упаривают до 100 мл,упаренный концентрат подкисляют до рН 3,5, 5-ОН-ИУК экстрагируют этилацетатом до полного извлечения,Экстракт высушивают над безводнымгча 250, упаривают досуха. Получают 970 мг5 кристаллического порошка с содержанием5-ОН-ИУК 100 6 (выход 97 ф ).Фракции, содержащие 4-0 Н-ИУК, объединяют, упаривают до 100 мл, подкисляютдо рН 3,05, 4-ОН-ИУК экстрагируют этилаце 10 татом до полного извлечения, Экстракт высушивают над безводным сульфатомнатрия, упаривают досуха, Получают 950 мгбелого аморфного порошка с содержанием4-ОН-ИУК 99,5 (выход 95).15 Таким образом, предлагаемый способпозволяет повысить качество препаратов 4 ОН-ИУК до 98 - 99,875 и 5-ОН-ИУК до 100при сохранении, а при получении 5-ОН-ИУКи повышении выхода за счет четкого отде 20 ления этих соединений друг от друга и отпримесей в процессе хроматографии, а также упростить процесс получения целевыхпродуктов за счет сокращения стадий выделения и очистки и эа счет сокращения опе 25 раций, где используются органическиерастворители. Кроме того, способ позволяетуменьшить вэрывоопасность и пожароопасность производства.Формула изобретения30 Способ выделения 4- и/или 5-оксииндолилЗ-уксусных кислот из раствора, предусматривающий экстрагирование гидрофобныморганическим растворителем и хроматографическое разделение целевых продуктов, о т л и 35 ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышениякачества целевых продуктов и упрощения способа, стадию хроматографического разделения проводят перед стадией экстрагированияпутем сорбции целевого продукта на гидро 40 фильном анионообменном сорбенте и элюции0,5-0,7 М раствором йаО,