Способ получения инсулина

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛ ИСТИ Ч Е СКИХ 180 РЕСПУБЛ ьаучине и нно к изо- фичеГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕВЕДОМСТВО СССР(71) Ереванский филиал Всесоюзногного центра хирургии АМН СССР(56) Авторское свидетельство СССРМ 552972, кл. А 61 К 37/26, 1977,(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНСУЛИ(57) Изобретение относится к медимедицинской промышленности, а имспособам получения инсулина. Целбретения - повышение выхода спец Изобретение относится к медицине, именно к эндокринологии, и может быть использовано в биотехнологии при получении лекарственных препаратов инсулина.Цель изобретения - повышение выхода человеческого инсулина и чистоты препарата, путем его накопления в среде процессом культивирования инсулинсинтезирующих эмбриональных клеток поджелудочной железы человека,Поставленная цель достигается следующим образом: поджелудочную железу эмбрионов человека 14-28 недельного возраста извлекают стерильно, измельчают на фрагменты и культивируют и чтго в питательной среде в ротационной установке, Ростовую среду с синтезированным в ней, растущими Р-клетками поджелудочной железы инсулином центрифугируют для удаления шлаков, супернатант отделяют, С целью стабилизации инсулина от разрушения, супернатант замораживают при температуре -18 С. Супернатантысобирают неоднократно в те 5 А 61 К 37/26, 35/39 ской активности целевого продукта и упрощение способа, Поставленная цель достигается тем, что в качестве сырья используют ткань поджелудочной железы 14-28-недел ных эмбрионов человека, культивируют ее в питательной среде Игла с добавлением 10 сыворотки крови человека в ротационной установке в течение 3-25 дней, смесь центрифугируют 5 мин при 500 об/мин, надосадочную жидкость собирают, замораживают при минус 18 С, размораживают, повторно центрифугируют 30 мин при 15000 об/мин с последующей лиофилизацией замороженных супернатантов,чение всего периода культивирования до физиологической гибели клеток (20-25 дней). Все супернатанты размораживают,объединяют и радиоиммунологическим ме- й тодом определяют в нем содержание инсулина. Супернатант вновь замораживают и лиофилизируют. Полученный сухой порошок и является целевым продуктом, Перед СО употреблением содержимое флаконов раэ- С водят дистиллированной водой и целевой ОЬ продукт употребляют в нативном виде,(Взависимости от задач исследований супер- (Я натант может быть разлит по флаконам с заведомо известным содержанием инсулина), В лиофилизированном состоянии целевой продукт можно хранить и использовать а в течение года,Способ осуществляют следующим образом; поджелудочную железу эмбрионов человека 14-28-недельного возраста извлекают стерильно, измельчают на фраг- . менты величиной 2-3 мм и культивируют в ростовой среде, в объеме 3-5 мл, состоящейиз среды Игла с 10( сыворотки крови человека. Среда Игла содержит набор аминокислот на сбалансированном солевом растворе и оптимально приближена к биологической среде клеток организма, Все это потребляется клетками для своей жизнедеятельности в процессе роста. Культивирование проводят в ротационной установке (в аппарате для культивирования тканей во вращающихся пробирках), Ростовую среду собирают после осаждения фрагментов поджелудочной железы путем центрифугирования при скорости 500 об/мин в течение 5 мин. Супернатанты отделяют, а к осадку фрагментов поджелудочной железы добавляют 3-5 мл свежей питательной среды для дальнейшего культивирования. Ростовую среду с растущих культур собирают многократно, каждые 3-4 дня, во время реновации среды в культурах, в течение всего периода культивирования (20-25 дней) и хранят при температуреС. Супернатанты размораживают, объединяют и центрифугируют при 15000 об/мин в течение 30 мин для осаждения шлаков и элементов разрушенных клеток. Радиоиммунологическим методом в супернатанте определяют содержимое инсулина набором (Са-ге-Яоги) Франция. Супернатант с известным содержанием инсулина разливают по флаконам, вновь замораживает и лиофилизируют. От одной поджелудочной железы в течение 25-днев- ного культивирования можно получить сухого вещества 246-250 мг с активностью ИРИ от 300-500 мед/мг инсулина. Неиспользованные клетками компоненты ростовой среды, вошедшие в сухой целевой продукт, во внимание не принимают, т.к., являясь оптимально приближенными к биологической среде клеток организма, они не могут вызывать побочных явлений. Перед употреблением содержимое флаконов с заведомо известньм содержанием инсулина разводят дистиллированной водой, в зависимости от задач исследований, и употребляют в нативном виде.В опытах было использовано 11 поджелудочных желез плодов человека разного возраста. Сливы с культур брались в динамике роста культур.П р и м е р 1. Культура М 2 от 25/Чг,Одну поджелудочную железу эмбриона человека 14 недельного возраста извлекают стерильно, измельчают на фрагменты величиной 2-3 мм.и культивируют в питательной среде Игла, содержащей 10 ф человеческой сыворотки в объеме 3 мл в ротационной установке, Каждые 4-е сутки культивирования центрифугированием при 500 оборотов в минуту в течении 5 мин супернатант отделяют и замораживают притемпературе -18 С, а к осадку добавляют 3мл свежей питательной среды для дальнейшего культивирования фрагментов поджелудочной железы, За 25 суткультивирования, во время реновации среды в культурах фрагментов поджелудочнойжелезы, было собрано и заморожено 5 супернатантов. Собранные супернатанты размораживались, объединялись ицентрифугировались при 15000 об/мин в течении 30 мин, после чего радиоиммунологическим методом определяли в нем155 содержание инсулина, Супернатант с известным содержанием инсулина замораживают и лиофилизируют, После лиофилизациисупернатанта с одной поджелудочной железы всего получено сухого порошка 246 мг с20 активностью ИРИ 295 мед/мг.П р и м е р 2, Культура М 1 от 5/Хг.Поджелудочную железу эмбриона человека 28-недельного возраста извлекают стерильно, измельчают на фрагменты25 величиной 2-3 ммз и культивируют в питательной среде Игла, содержащей 10 человеческой сыворотки в объеме 3 мл вротационной установке. Каждые 4-е суткикультивирования супернатант, центрифуги- .30 рованием 500 об/мин в течение 5 мин, отделяют и замораживают при температуре-18 С, а к осадку добавляют 3 мл свежейпитательной среды для дальнейшего культивирования фрагментов поджелудочной35 железы. За 25 сут культивирования собранои заморожено 5 супернатантов. Собранныесупернатанты размораживались, объединялись и центрифугировались при 15000об/мин в течение 30 мин, после чего радио 40 иммунологическим методом определяли внем содержание инсулина. Супернатант сизвестным содержанием инсулина замораживают и лиофилизируют.После лиофилизации супернатанта все 45 го получено сухого порошка 250 мг с активностью ИРИ 480 мед/мг.Как видно из примеров, количество инсулина, синтезированного одной поджелудочной железой, колебалось, что,50 по-видимому, связано с возрастом плода ивеличиной поджелудочной железы.Данный способ дает возможность получить от одной поджелудочной железы целевой продукт в виде сухого порошка с55 активностью инсулина до 500 мед/мл, что в10000 раз превышает активность препаратапо известному способу, кроме того, предла-,гаемый способ не требует очистки препарата, который может быть использован внативном виде,1806751 Составитель М. БасмаджянТехред М,Моргентал Корректор А. Мотыль Редактор С. Кулакова Заказ 1344 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород; ул.Гагарина, 101 Сухое вещество, полученное из супернатанта подвергали биологическому тестированию на инсулин, который при введении животным снижает сахар в крови, вызывает гипогликемические судороги и гибель животных, Судорожный тест был поставлен на 20 белых мышах и на 10 крысах с аллоксановым диабетом, у которых сахар крови составлял 300-400% мг, Лиофилизированный порошок предварительно разводили дистиллированной водой до концентрации инсулина 40000-50000 мкед/мл, которая вызывала четкий судорожный эффект и гибель животных, Гипогликемический эффект наблюдался у крыс с аллоксановым диабетом при введении им целевого продукта в количестве 5000-6000 мкед/мл, что еще раз явилось подтверждением наличия инсулина в порошке, обладающего биологической активностью,Таким образом, в 1 мг,. получаемом по данному способу сухом порошке, активность человеческого инсулина в 10000 раз выше, чем по известному способу. Биологическое тестирование и радиоиммунологические данные подтвердили это. Человеческий инсулин, полученный данным способом, может быть использован как препарат в нативном виде, т.к. незначительные примеси, являясь компонентами ростовой среды, максимально приближенные к биологической среде организма, не могут вызывать побочные явления в организме человека, по сравнению с известными препаратами инсулина.Заявленный способ может быть использован;при изготовлении стандартных форм инсулина человека для радиоиммунологических наборов;технология данного способа может быть использована в лабораторных условиях для получения инсулина всех видов животных;полученный данным способом лиофилизированный порошок, содержащий инсулин, может быть использован без очистки в5 нативном виде, как биостимулятор в клинической практике при заживлении ран;возможность получения гормоноактивных временных линий из эмбриональныхподжелудочковых желез, установленная в10 той же лаборатории, позволит в перспективе накапливать человеческий инсулин, применение которого позволит избежатьосложнений и сложных иммунологических15 реакций в организме больного, присущихприменяемым сейчас, представленным препаратам инсулина.Предлагаемый способ прост и доступен,не требует сложного оборудования, ценного20 продукта - крови человека, исключает процесс очистки,Формула изобретенияСпособ получения инсулина из поджелудочной железы человека путем измельче 25 ния исходного сырья, очистки, охлажденияс последующим выделением целевого продукта, о т л и ч а ю щ и й с я тем. что, с цельюупрощения способа, повышения выхода испецифической активности целевого про 30 дукта, в качестве сырья используют тканьподжелудочной железы 14-28 недельныхэмбрионов человека, культивируют ее в питательной среде Игла с добавлением 10 о - ной сыворотки крови человека в35 ротационной установке в течение 3-25 дней,смесь центрифугируют 5 мин при 500об/мин, надосадочную жидкость, содержащую целевой продукт, собирают, замораживают при температуре -18 С,40 размораживают, повторно центрифугируют30 мин, при 15000 об/мин и лиофилизируютзамороженные супернатанты.