Способ определения -амилазы поджелудочной железы

1сОюэ соВетскихсоциАлистичеснихРЕСПУБЛИК 80163Р) С О Я ЗЗ/577 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯН ПАТЕНТУ ГОсудАРстВенный Комитетпо иэовРетениям и отнРытиеапи гннт сссР(71) Берингер Мзннхайм ГмбХ (ОЕ)(57) Изобретение относится к иммунологической диагностике в(-амилаэы поджелудочной железы наряду, с определенИзобретение касается способа определения 0(-амилазы поджелудочной железы наряду с 0(-амилазой слюны для диагностических целей,Целью.изобретения является повышение точности определения О(-амилаэы поджелудочной железы.Способ осуществляют следующим образом.Ингибируемая эффективность моноклонального антитела, которое не полностью удовлетворительно подавляет фермент слюны, синергически усиливается с помощью лишь связующего, но практически не подавляющего или не полностью подавляющего моноклонального антитела, и количественное подавление фермента слюны может быть дос 2ным ж-амилазы слюны. Цель - повышение точности определения 0(-амнлаэы поджелудочной железы, Для этого к исследуемому материалу добавляют моноклональные антитела штаммов САСС84122003 или САСС8412204 в концентрации 5 - 20 мкг/мл с активностью связывания К-амилазы слюны более 97%. Далее добавляют дополнительно вторые моноклональные антитела против 0(-ами" лазы слюны штаммов САСС М 84 111301 или 84 111302 в равном объеме и концентрации 1 - 5 мкг/мл с активностью связывания фермента более 10%, Смесь инкубируют 0,5 - 1 О мин при 20 - 37 С и рН 7,1. Точность определения возрастает до 100,2%, по прототипу 90%.2 таблтигнуто при получении 100%-ной активности фермента поджелудочной железы. Таким образом удается существенно сократить время инкубации,Для предлагаемого способа в качестве первого моноклонального антитела используют предпочтительно полу- . ченные из зарегистрированных в МСАСС под номерами (99012) 84 122003 и (89 Е 2) 84 122004 (Национальная коллекция животных клеточных культур, Нортон Даун, Великобритания) клеточных культур антитела. В качестве второго моноклонального антитела предпочтительно используются опубликованные в европейской заявке8411472,4 связующие антитела, зарегистрированные в ЯСАСС под номерами 84 111301 и84111302 клеточных культур (предпочтительно 11 САСС84111301) .Необходимое всякий раэ количество первого и второго антитела для определенных препаратов антител можно легко определить с помощью небольшого количества предварительных опытов, Предпочтительно используют по меньшей мере 5 мкг/ып, бопее предпочтительно по меньшей мере 20 мкг/мп первого моноклонального антитела и по меньшей мере 1 мкг/мл, более предпочтительно по меньшей мере 5 мкг/мл второго моноклонального антитела, 15Применяемые моноклональные антитела могут быть получены путем иммунизации подопытных животных с помощью естественной или модифицированной К-амилазы слюны, слияния В-лимфоцитов 20 полученных таким образом иммунизированных животных с трансформируемыми реактивами, клонирования и культивирования образованных таким образом гибридных клеток, которые производят 25 моноклональные антитела, и путем изолирования последних, Пригодными животными для производства антител )(-амилазы слюны являются крысы и мыши.30Иммунизация осуществляется или г. помощью естественной челонечегкои )с-амилазы слюны или с помощью модифицированной амилазы слюны. Если используют естественный Фермент, то для этого пригодны стандартные, электро форетические гомогенныс среараты. Химически модифицированная Ос-амилаэа слюны может быть также цгчучс на н гоответгтвии с извегтными и1 да.и модификации ферм. тон (иубикоснная 40 заявка ФРГ Ф 254 )994). Ригодньм модифицирующими сред. твами я пляктг я, например, -бр имя нга р никид ВБ)ри окислении груп: триптофа га н протеи 45 не (ВВА 1 ч 3 (1967) 462-ч 72), крбсксиметилирование г эфирм ио укгугиои кислоты (1 АА), которое н нвнсм воздействует на гигзиив, и. и иитрирование с тетранитромеом ( 11) В 1 с 1, СЬесп, 238 (196 1) 3307), а 50 также диазотировани;иронаннсъ сульфанилоп й кисл с и (,1 .1. Епгупс 1, (25 /1972) 51. -), Г этом наиболее подх ящй чиФр нанньи с помощью ТЬИ 1)риг снии иолнлх (л ик)ите.гневяс Фе)1 м ни ,, (сидомовых мьипей Иммунизация осуществляется путей обычного введения естественного или модифицированного фермента в комбинации со стимулятором, В качестве стимулятора используется гидроокись алюминия в сочетании с бактерией (возбудителем коклюша Борде - Жангу), Если для иммунизации ис пользуется естественная с-амил 1 за слюны в домовых мышах или ТМ-модифицированная К-амилаза в полевых (лесных) мьииах, то иммунизация ос уществля ется преимущественно в течение 9 мес, с помощью по меньшей мере семи иммунизаций (инъекций 1.Р,),После проведенной иммунизации происходящие из костного мозга лимфоциты иммунизированных животных соединяются обычными методами с трансформирующими агентами, например клетки миеломы, трансформирующие вирусы, например вирус Эпштейна-Барра или описанные в высоженной заявке ФРГ3245665 агенты, Соединение осуществляетгя в соответствии г известными гпо.обами Келера и 11 ильштейна (а:цге 256 (1975) 495-497). Образованные ири этом гибридные клетки клонируются обычным образом, наример с применением стандартной клеточной породы, и полученные клоны, которые образуют желаемые моноклональные антитела, выращиваются. По причине напоминающегс рак роста Гибридных клеток последние можно продолжать культивировать в течение неопределенноговремени и производить желаемое моноклональное антитело в любом количестве. Дн редлагаемого способа оиределенин могут рименятьгя опиганные моноклональные антитела или имеющие их гоотнетг.твЮщие иммунологические свойгтва фрагменты (фаб-Фрагменты). Поэтому од понятием моноклональные антитела" н данном случае понимаются и Фрагменты, Как комплекг.ное антитело, так и его фрагменты, могут использоватьсяя в иммобилизированной форме.0 средление Х-амилаэы осущегтвляетгя в соответствии с известными для этих целей методами, Так как комбинация моноклональньгх антител с елекгивно поданят Э-амиаэу глкннсго типа и она таким образом позволяет определять актинность фермига, не ричинян ущерба ферменту лодж лудоч7670 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 5 163ной железы, полученные прн определении К-амилаэы в присутствии моноклонального антитела величины соответствуют подобающей только ферменту поджелудочной железы активности,Предлагаемый способ реализуетсяпредпочтительно с помощью системыдля обнаружения К-амилазы, котораясодержит мальтополиозу с 4-7 остатками глюкозы в молекуле, мальтофосфорилаэу, -фосфоглюкомутаэу, глюкозо-фосфатдегидрогеназу и дифосфопиридиннуклеотид,Другая предпочтительная системаобнаружения К-амилазы состоит измодифицированного с помощью определяемых групп крахмала. Понятие "модифицированный крахмал" охватывает,например, крахмал, который модифицирован с помощью определяемых групп,например, стандартный продукт подназванием "РЬайеЬаз" фирмы "Фармациа"(Швеция), или описанный в выложеннойзаявке ФРГ В 2812154 продукт, илиизменившийся в процессе распада крахмал, например карбоксиметилкрахмал ипредельные декстраны (все эти системы известны).Для реализации предлагаемого способа исследуемая жидкость или вначале инкубируется с помощью использованных в способе антител и затемиспользуется непосредственно в обычном испытании амилазы, или добавляется в смесь антител с реактивом обнаружения. амилазы и затем после инкубации начинается определение путемдобавки субстрата, Продолжительностьпериода инкубации зависит от активности использованных антител и составляет от 0,5 до 10 мин, в частности примерно 5 мин,Поскольку отделение М-амилазы слюны оказывается желательной, то одноиэ моноклональных антител, как вкомплексной форме, так и в ф-рме фрагментов, может существовать эафикси-рованным на твердом носителе, например на иммуносорбционной бумаге илина поверхности трубочек из синтетического материала или гибких трубочек, Таким образом К-амилаза слюнного типа привязывается к носителю(т.е. твердая фаза)Моноклональные антитела, которыеудельно подавляют человеческую Ь-амилазу слюны максимум до 933, очищаются путем осаждения (ИН) БО и с помощью РЕАЕ-хроматографии в соответствии с обычными методами, Также очищается моноклональное антитело, которое удельно связывает человеческую -амилаэу слюны. Моноклональное анти- тело или моноклональные антитела смешиваются в растворе с человеческой амилазой и эта смесь инкубируется в течение 5 мин при комнатной температуре. Затем эта смесь добавляется к реактиву амилаэы и измеряется активность амилаэы. В качестве контроля служит амилаза, которая смешана с буфером .без моноклонального антитела. Альтернативное моноклональное антитело или моноклональные антителадобавляются в часть реактива амилаэы,раствор глюкозидазы, Затем добавляется раствор амилазы и смесь инкубиру-ется в течение 5 мнн. Начинается рефакция с субстратом - С 7 РИР (Р - нитрофенилмальтогептаоэид), В качествеконтроля служит раствор глюкозидаэыбез моноклонального антитела,В табл.1 представлены результатыметода сывороточного начала, (смешанымоноклонапьное антитело и амилаза):подавление человеческой (-амилазы слюны и поджелудочной железы с помощьюподавляющих моноклональных антителИСАСС 84 122003 (МАК 1) или 84 122004,(МАК 11) и/или связующего моноклонального антитела НСАСС 84 111301 (МАКПО (в качестве субстрата С 7 РИР,СА - общая активность, А - активность с моноклональнымн антителами,ВА - остаточная активность),. Из табл. 1 видно, что комбинацияподавляющего удельного моноклонального антитела, а также удельно связующего человеческую О(-амилаэу моноклонального антитела воздействует насинергическое увеличение подавления.Этот эффект не зависит от субстрата,Это обнаруживается как при высокомолекулярном субстрате (окрашенныйкрахмал), так и при субстратах с короткой цепью, например С 5 РИР (Рнитрофенилмальтопентаоэид). Эффектнаблюдается также при субстрате СРИР,Слюнная амилаза также подавляется вчеловеческом организме синергическис помощью двух моноклональных антител,Реактив для удельного определения Ы-амилазы поджелудочной железы наряду с М-амилазой слюны в жидкостяхорганизма, в частности в сыворотке,соке двенадцатиперстной кишки, плазме или моче, содержит систему дляобнаружения К-амилаэы и моноклональ 5ное антитело против К-амилазы слюны,которая отличается тем, что содержитпервое моноклональное антитело, которое подавляет фермент слюны менеечем до 97%, ииспользуется в комбинации с вторым моноклональным антителом против М-амилазы слюны, кото.рое подавляет этот фермент менее чемдо 10%. Итак, в предлагаемом реактиве содержится система для обнаруженияМ-амилазы,Изобретение способствует просто-му, быстрому и точному определениюК-амилазы поджелудочной железы (Ь-РА)наряду с М-амилазой слюнного типа 20(Ь-ЗА) в жидкостях организма и су. щественно улучшает тем самым возможности клинической диагностики.П р и м е р 1, Подавление человеческой К-амилазы поджелудочной железы и слюны с помощью первого МАК(ЯСАСС 84122004) и в комбинации совторым МАК (ЯСААС 84111301) методсывороточного начала.Реактив (буфер) 100 млмоль РО ЭОи 150 млмоль ЯаС 1, 6%: сывороточногоальбумина крупного рогатого скота,рН 7,1.Реактив амилазы: С 1 РЯР (Берингер,Мангейм, номер заказа по каталогу568569, 37 С)еМАК 1: 0,63 мг/мл первого МАК вбуфере,МАК 2 ф 0,63 мг/мл первого МАКи 0,105 мг/мл второго МАК в буфере. 40МАК 3: 0,105 мг/мл второго МАКв буфере.При этом, ЬА - 3000 мочевины/л(СтРЯР) в буфере, Ь-РА - 3000 мочевиныл (СРЯР) в буфере. , 45100 мкл чеэвеческой Ы-амилазыслюны или поджелудочной железы смешивают со 100 мкл буФера или различных растворов моноклональных антители в течение 5 мин инкубируют при комнатной температуре. Затем 25 мкл этихсмесей добавляют к 1000 мкл поддерживаемого при постоянной температуре37 С реактива амилазы и в соответствии с инструкцией определяют активность амилазы, Остаточную активность рассчитывают по формуле КА,%Активность с МАК,Активность беэ МАК Соответствующие остаточные активности человеческой Ы-амилазы слюнысоставляют с первым МАК 8,6%, со вто"рым МАК 96,9%,и с обоими МАК 2,7%,остаточные активности человеческойд"амилазы поджелудочной железы соответственно составляют 100,1, 99,6и 99,7%,П р и м е р 2. Подавление амилаэы с помощью первого МАК (ЯСАСС84 122003) и/или второго МАК (ЯСАСС84 111301); вариант сывороточного начала,Реактивы аналогичны используемымв примере 1, только изменены МАК 1и МАК 2,МАК 1 : 0,525 мг/мл первого МАКв буфере,МАК 2: 0,525 мг/мл первого МАКи 0,105 мг/мл второго МАК в буфере,Опыт проводят аналогично примеру 1,Остаточные активности человеческойМ-амилазы слюны составляет с первымМАК 9,1%, со вторым МАК 96,9% и собоими МАК 2,5%, остаточные активности человеческой Ю-амилазы поджелудочной железы соответственно составляют99 в 9 ь 99 ю 6 и 99,7%.П р и м .е р 3. Подавление человеческой К-амилазы слюны и поджелудочной железы с помощью первого МАК(ЯСАСС 84 122004) со вторым МАК илибез него (ЯСАСС 84 111301), метод субстратного начала.Реактивы: буфер, человеческая Камилаэа слюны (Ь-ВА) и человеческая М "амилаза поджелудочной железы (Ь-РА) как в примере 1.МАК 1 : первое МАК в буфере, разя,личные концентрации.МАК 2": второе МАК в буфере 0,513 мг/мл,При этом, 1(-глюкозидаэа из реактива амилазы (Нерингер, Мангейм, номер заказа по каталогу 568569), субстратСуРЯР иэ реактива амилазы,К 880 мкл щ-глюкоэидаэы добавляютЙ100 мкл раствора МАК 1 , а также10 мкл раствора МАК 2" или 10 мклбуфера. К этой смеси подмешивают25 мкл человеческой -амилазы слюныили поджелудочной железы. Эту смесь в течение 5 мин инкубируют при 37 С. Затем путем добавки 100 мкл раствора субстрата происходит начало и осуществляется в соответствии с инструкцией определение активности амилаэы.Амин а за А, ги/л ( НА, Ж А, ин/л КЛ, Х А, ел/л 8 Л, 3 Л, ед/л ВА, 3 А, ец/л КЛ, Х 1476 127 8,6 135 9,) 1430 96,9 40 2,7 37 2,5 СаинаПопхелулочнаа хелеэа 1430 1442 100,8 428 99,9 (424 99,6 1405 98, 2426 99,7 Та бли ца 2 ПоказателиМАК 1 / МАК 1 МАК 111 МАК 111 МАК 1/111 МАК 1/111.аказ 828 Тираж 411 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям ири ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул, Гагарина,101 В качестве контроля служит смесь К- глюкозидазы с 20 мкл буфера, а также соответствующей амилазы. Активность с моноклональными антителами, поделенная на активность без моноклональных антител, дает остаточную активнос гь (в процентах).Результаты опытов для различных концентраций сведены в табл,2, 1 О Данные табл,2 свидетельствуют о том, что используемые концентрации антител позволяют с высокой точностью определять 0(-амилазу поджелудочной 15 железы (по известному способу лишь 907).Формула и з о б р е т е н и яСпособ определения а(-амилазы поджелудочной железы в биологических жидкостях, включающий добавление моноклональных антител против а/-амилазы слюны к исследуемому материалу споследующей регистрацией К -амилазыподжелудочной железы, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью повышения точности способа, в качестве мсноклональных антител используют антитела штаммов САСС 8 84 122003 илиСАСС 1(9 84122004 в концентрации 520 мкг/мл с активностью связывания8(-амилаэы слюны более 973, далее дополнительно добавляют вторые моноклональные антитела против 8(-амилаэыслюны штаммов САСС )к 84 111301 илиУ 84 111302 в равном объеме и концентрации 1 - 5 мкг/мл с активностью связывания фермента более 107, смесь инкубируют в течение 05 - 10 мин.