Способ получения аллергена

(51)5 ЕДОМСТВО ССС ОСПАТЕНТ СССР ТЕНИЯ Б В С 1,Ь ОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕ(56) Авторское свидетельство СССРйг 1009472, кл. А 61 К 39/35, 1983,(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АЛЛЕРГЕНА(57) Изобретение относится к медицине иможет быть использовано в аллергологии ииммунологии для диагностики аллергических заболеваний и выявления сенсибилизации в лабораторных условиях прииспользовании в иммунологических тестахв контакте с волокнистой растительнойпылью. Целью изобретения является повышение специфичности целевого продукта,Изобретение относится к медицине и может быть использовано в аллергологии и иммунологии для диагностики аллергических заболеваний и выявления сенсибилизации в лабораторных условиях при использовании в иммунологических тестах у работающих в контакте с волокнистой растительной пылью.Цель изобретения - повышение специфичности целевого продукта.Укаэанная цель достигается тем, что по способу получения аллергена из смешанной растительной пыли (джута, льна, кенафа) путем экстракции исходного сырья в 2,5, раствор хлорида натрия при температуре от 4 до 10 С в течение 5-7 сут при соотношении сырья/экстрагирующий раствор 1:20, прессования, фильтрации экстрата, выдержива) 1806752 Сущность изобретения заключается в экстракции смешанной растительной пыли из джута, льна и кенафа 2,5-ным раствором хлористого натрия при соотношении сырье:растворитель 1:20, в течение 5-7 суток, прессования осадка, фильтрации экстракта, осаждении примесей, обработки экстракта бензойно-кислым натрием и его подкислении соляной кислотой, обработке образовавшегося осадка охлажденным ацетоном, его промывке, сушке, обработке нейтральным фосфатным буфером, содержащем фенол, удалении образовавшегося осадка и фильтрации, Положительный эффект заключается в повышении специфической активности в тестах специфической стимуляции нейтрофилов. 1 табл. ние экстракта при температуре от 4 до 10 С, центрифугировании и фильтрации, обработки экстракта бензойно-кислым натрием и 0,1 нормальным раствором соляной кислоты, обработкой ацетоном, охлажденным до -20 С в течение 18-24 ч при этой температуре, отделением целевого продукта от ацетона фильтрацией, подсушиванием целевого продукта, экстрагированием высушенного целевого продукта нейтральным фосфатным буфером, содержащим 0,2-0,4;4 фенола в течение 3-4 сут при температуре от 4 до 10 С,П р и м е р, Исходное сырье зкстрагируют 2,50/-ным раствором хлорида натрия в течение 5-7 сут при соотношении сырье/экстракт 1;20. Полученную смесь фильтруют через два слоя батиста, осадокпрессуют и удаляют, экстракт повторно фильтруют, выдерживают при температуре от 4 до 10 С в течение 16-20 ч и затем центрифугируют при 25000 Д, осадок удаляют, К экстракту добавляют бензойно-кислый натрий из расчета 20 г/л, устанавливают РН в пределах 3,3-3,7 внесением НС 1.В результате образуется бензойная кислота, на которой адсорбируется аллерген,Для отделения аллергена от бензойной кислоты осадок растворяют в ацетоне, охлажденным до минус 10-20 С и выдерживают 18-20 ч при этой температуре. При этом бензойная кислота растворяется в ацетоне, целевой продукт выпадает в виде хлопьев в осадок. Аллерген отделяют от ацетона фильтрованием, фильтрат удаляют, а осадок промывают охлаждением до -20 С ацетоном, подсушивают при комнатной температуре не менее 24 ч, после чего обрабатывают нейтральным фосфатным буферным раствором с 0,2-0,4 офенолом в течение 3-4 сут при температуре от 4 до 10 С при периодическом встряхивании для лучшего растворения осадка, затем экстракт центрифугируют при 6000 об/мин, осадок удаляют, экстракт фильтруют через бумажный фильтр, проводят диализ, коррекцию РН.Анализ предполагаемого технического решения по критериям Новизна" и "Существенные отличия" показал следующее: новым является использование в качестве исходного сырья смешанной растительной пыли из джута, льна, кенафа и льна, а также использование для первичного экстрагирования раствора хлорида натрия, получение очищенного препарата, освобожденного от балластных веществ, высокоспецифичного, который может быть использован как и чИго так и и ч 1 чо, что расширит диагностические возможности в клинике и лабораторных исследованиях в клинической иммунологии.П р и м е р: в результате обследования работающих в контакте со смешанной растительной пылью (джута, льна, кенафа) при кожном тестировании с аллергеном, приготовленным по известному способу выявлен одинаковый процент положительных реакций с аллергеном, приготовленным по заявляемому способу. В то же время и ч 11 го процент выявленных сенсибилизированных лиц по заявленному способу значительно более высокий, чем при тестировании 1 и чиччо по известному способу, приготовленного аллергена.Положительный эффект полученного новым заявленным способом аллергена из смешанной растительной пыли был установлен при использовании его в НСТ-тесте для выявления сенсибилизации к производственной пыли в инвитровой лабораторной методике.НСТ - тест заключается в том, что бес цветный раствор красителя нитросинего теразолия (НСТ) при инкубации со взвесью лейкоцитов фагоцитируется активными нейтрофилами и под влиянием лизосомного фермента НАДФ - оксидазы восстанавли вается в нерастворимый формазан темносинего цвета, который легко идентифицировать в нейтрофилах визуально цит, ко К.А,Лебедев, И.Д.Понякина" Иммунограмма в клинической практике", М, "Наука", 1990, с, 76).Постановку метода осуществляют обычно в цельной крови по методу Раг 1 В.й. и соавт(1968), мы проводили ее с включением модификации Ю.И,Бажора и соавт.20 (1981), сммонографию "Лабораторные методы исследования в клинике" под ред.В.В,Меньшикова, М., "Медицина", 1987, с.135 (в нашей модификации. - изобретение подтверждено на уровне государственной 25 патентной экспертизы М 4675777) 30-14(051990 от 21.04,89 г).Каплю крови смешивают на предмет- оном стекле с раствором НСТ, инкубируют при 37 С в течение 30 мин, затем в предва рительно окрашенном мазке просчитываютколичество нейтрофилов, содержащих гранулы формазана. НСТ - тест до настояЩего времени применялся для оценки фагоцитарной активности нейтрофилов, мы его ис пользовали и для лабораторнойдиагностики сенсибилизации к приготовленному заявленным способом аллергену, добавляя его к крови обследованных контингентов, Забор крови проводили из паль ца у рабочих длительно контактирующих сволокнистой растительной пылью джута, льна, кенафа (более 10-15 лет) из них 24 чел, с профессиональным заболеванием текстильщиков - биссинозом в фазе ремиссия, 45 42 стажированных рабочих из цехов обработки текстильного сырьяВсе они были предварительно обследованы клинически и иммунологически с применением различных методов50функциональной. диагностики (ЭКГ, Эхо КС, спирография, пневмотахометрия, спировелоэргометрия) рентгенологических и имму.нологических тестови П уровня.Полученные данные сопоставлены с резуль 55 татами обследования 30 здоровых лиц (доноры) однородных по полу и возрасту собследованными контингентами рабочих.В таблице представлены результаты втесте специфической стимуляции нейтрофи1806752 лов (НСТ - тест в собственной модификации) к смешанной растительной пыли. Составитель В. АваковТехред М,Моргентал Корректор И. Шулла Редактор С, Кулакова Заказ 1344 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул,Гагарина, 101 Формула изобретенияСпособ получения аллергиона путем экстракции растительной пыли в течение 5-7 5 сут, фильтрации экстракта, осаждения примесей, обработки экстракта бензойно-кислым натрием и его подкислением соляной кислотой, обработки образовавшегося осадка охлажденным до (-20) С ацетоном, 10 фильтрации, промывки осадка охлажденным ацетоном его сушки, обработки нейтральным фосфатным буфером, содержащем фенол в течение 72-96 ч при температуре 2-10 С, удалении образовавшегося осадка и фильтрации целевого продукта, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью повышения специфичности, в качестве растительной пыли используют смешанную растительную пыль из джута, льна и кенафа, а экстракцию. проводят 2,5-ным раствором хлористого натрия при соотношении сырье:раствори- тель 1:20.