Штамм лимфоидной клеточной линии человека номо sapiens, используемый в качестве тест-объекта для изучения действия мутагенных, лекарственных и вирусных препаратов

ЕНИЯ 1. Ехр, Раей г й КЛЕТОЧНОЙ ЛИНИИБ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙКТА ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯЛЕКАРСТВЕННЫХ И от- СЖ И ининоме о к биологии спользовано для изучеутагенных в, а также и ь ето енных, аратов Штамм озом ериф ем н ования без призна е среды культ еленных п ческои крови,стеклу, активно ельную среду, с прикрепления фугироваграфин. оскоростного цен адиенте фиколл-в метаболизируя пита ия ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗ ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ 1(71) Научно-исследовательский институт экспериментальной патологии и трапии АМН СССР и Институт цитологиАН СССР(56) АягЬа Ч.2, ес 1979, 17, з,228-236 (54) ШТАММ ЛИМФОИДН ЧЕЛОВЕКА НОМО БАР 1 Е В КАЧЕСТВЕ ТЕСТ-ОБЪ ДЕЙСТВИЯ МУТАГЕННЫХ ВИРУСНЫХ ПРЕПАРАТОВ Изобретение относитсяедицине и может бытьачестве тест-культуры действия различныхекарственных препаратусных агентов. зобретения - получение шта ной линии человека, пригод испытания различных лекарс тагенных и вирусных преС(ОМ)2 получен в 1982 г. ьного острым монобластным леи при культивировании лимфоцито 8015130 1(57) Изобретение относится к областибиологии. и медицины и может бытьиспользовано в вирусологии и молеку"лярной биологии. Цель изобретенияполучение штамма клеточной линии человека, пригодного для испытания различных лекарственных, мутагенных ивирусных препаратов, Штамм депонирован под номером ВСКК (11) В 153 Д. амм получен при культивированиимфоцитов периферической крови болго острым монобластным лейкозом. Кариотип клеток в части случаев мальный, а в части случаев патол ческий, имеется два маркера, что зволяет использовать штамм как т культуру для изучения механизма ствия вирусов, канцерогенов, а т лекарственных препаратов. 1 табл тамм лимфоидной клеточно Ношо Яар 1 епз депонирован под н р м ВСКК(11) У 153 Д и характеризуется следующими признаками.Морфологическая характеристика и культуральные свойства. Штамм ЛС(ОМ)-2 представляет собой лимфоидную культуру клеток, которая без существенных изменений фенотипических, морфологических и биологических свойств, размножается в течение 5 лет. Основной особенностью штамма является его способность пролиферировать в суспензионном состоянии в жидкой фавысокая активность нафтол АЯ-ацетатэстеразы, обнаруживаются липиды.Вирусологическая характеристика.Электронно-микроскопическая характеристика. При исследовании ультра- тонких срезов клеток штамма ЛС(ОМ)-2 (приготовленных на ультратоме ЬКВ после фиксации клеток штамма 37.-ным раствором глютарового альдегида с последующей дополнительной фиксацией,контрастированием уранилацетатом и цитратом свин ца) в электронном микроскопе ЗЕМ 100 В выявлены частицы с морфологической структурой вируса герпеса в 0,57 клеток.Изучение изоэнзимного состава клеток штамма ЛС(ОМ)-2, Для изучения изоэнзимного состава лактатдегидрогеназы (ЛДГ).и глюкозо-фосфатдегидрогеназы (Г 6 ФДГ) в клетках штамма710 клеток промывают в растворе Хенкса, добавляют 100 мкл дистиллированной воды, интенсивно пипетируют, и клеточный детрит осаждают при 12 000 об/мин в течение,10 мин. Надосадок используют для тестирования ферментативной активности. Пробы подвергают ЭФ (электрофорезу) в полиакриламидном геле (77). После проявления ферментативной активности установлено, что в клетках ЛС(ОМ)-.2 ЛДГ пред ставлена 5 изоэнзимами с различными электрофоретическими подвижностями, что характерно для отряда приматов. Г 6 ФДГ представлена одним изоэнзимом типа В, характерным для людей белой расы. Чувствительность к вирусам. Чувствительность клеток штамма ЛС(ОМ) -2 к парамиксовирусам птиц определена на примере вируса болезни Ньюкасла и семейству рабдовирусов на примере вируса везикулярного стоматита, серотип Индиана. Клетки штамма не выявляют высокой чувствительности к обоим указанным вирусам.П р и м е р 1. Клетки штамма в среде НРМ 1 1640 в сочетании с 157.сыворотки крупного рогатого скота в количестве 5 х 10 кл./мл расфасовывают в пробирки по 2 мл. Клетки отмывают от сыворотки, осаждают центрифугированием при 1000 об/мин в течение 5 мин и к полученному осадку добавляют по 0,2 мл вируса везикулярного стоматита, серотип Индиана, и вируса болезни Ньюкасла, Контакт вирусов с Цитохимическая характеристика. Цитохимический анализ клеток штамма50 ЛС(ОМ)-2 выявляет их В-лимфоидную принадлежность, на основании определения высокой пиронинофиллии цито- плазмы присутствия гранул гликогена,Ф55определяемого по методу ЫИК (реакция Мак-Мануса), отсутствия активности пероксидазы и щелочной фосфатазы. В клетках штамма определяется также 3 1513031 образованием различной формы и величины клеточных конгломератов, видимых невооруженным глазом. Ытамм отличается также простотой культивирования, так как размножается на питательной среде ВРМ 1 1640 с добавлением 157. инактивированной прогреванием бычьей сыворотки, .-глютамина (300 мкг/мл) и антибиотиков в стационарном состояо нии в обычном термостате при 37 С. Время удвоения клеточной массы 24 ч. Оптимальная концентрация клеток (3-4)х 10 кл,/мл. Процент живых клефток колеблется в пределах 85-927 15 Способ культивирования суспензионный. Кратность рассева 1:2-1:3 каждые 5 дней. Клетки хорошо переносят криоконсервацию. В качестве криопротектора используется диметилсульфоксид 20 в конечной концентрации 87.Морфологически штамм состоит из лимфобластов, составляющих 92-957. всей клеточной популяции. Клетки полиморфны, крупные, ядра округлыеили овальные и содержат по одной крупной нуклеоле или изредка две мелкие.Цитогенетическая характеристика. Цитогенетический анализ клеток линии ЛС(ОМ)-2 позволяет выявить наличие30 модального класса с 46 хромосомами, Анеуплоидные в основном, гиподиплоид-ные клетки составляют всего 107 Дифференциальная окраска хромосом на С-диски дает возможность устано вить, что в пределах одного модального класса имеется два клеточных клона: 2 п=46, ХУ (нормальный кариотип) и 2 п=46, ХУ, -2, -12, М, М Мс 1 е 1 2(р 12) и М = г. (2, 12), (р 12; 40 р 13),Второй клон клеток составляет 207. популяции.Дифференциальная окраска хромосом на С-диски дает возможность найти общий хромосомный маркер для обо их клонов - инверсию структурного гетерохроматина в одной из 16 хромосом.К--- 100 где К - количество клетокК ф Формула изоб р етения Вирус Количество мертвых клеток, Х, через Ф24 ч 48 ч 72 ч 96 ч 120 ч Вирус везикулярного стоматита Вирус болезни НьюкаслаКонтроль 20 10 29 33 40 29 32 8 10 25 10 20 58 8 Составитель А.МаныкинТехред Л.Олийнык Корректор Л.Бескид Редактор В,Петраш Заказ 6043/27 Тираж 501 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101 5 151клетками проводят при 37 ОС в течение1,5 ч, после чего вирусы отсасывают,а к клеткам добавляют ростовую среду.Опытные и контрольные (вместо вирусавносят питательную среду) пробиркипросмагривают ежедневно в световоммикроскопе. Степень цитопатическогодействия оценивают по числу мертвыхклеток, для чего ежедневно просчитывают их, смешивая суспензию клетокс равным объемом 0,2 Е-ного растворатрепанового синего,Результаты представлены в таблице.Как видно из таблицы, клетки штамма не проявляют выраженной чувствительности к указанным вирусам. Это свойство штамма делает его ценным для изучения механизма избирательного действия вирусов на клетки различных штаммов.П р и м е р 2. Проведено испытание клеточной линии ЛС(ОМ)-2 на чувствительность к антипролиферативному действию рекомбинантного интерферона ю , Клеточную культуру выращивают в среде КРМ 1 с добавлением 107 фетальной сыворотки коров; в опы- те используют 1-суточную культуру в концентрации .3 10 кл ./мл. Исходная концентрация интерферона составляет 1 мкг/мл. В 96-ячеечной пластине го 3031 6товят 2-кратные разведения интерферона в среде для выращивания клеток(с 1:2 по 1:128) в объеме 50 мкл,используя по 3 лунки на каждое разведение. Затем в каждую лунку вносятпо 50 мкл суспензии клеток. На 3-иосутки инкубации при 37 С в термостате с 5 Х СО клетки подсчитывают вкамере Фукса-Розенталя. Процент ингибиции подсчитывают по формуле в контроле; 0 - количество клеток вопытеПри концентрации интерферона500 нг/мл ингибиция составляет 703,при 125 нг/мл - 507., при 31,25 нг/мл -313, что свидетельствует о высокойчувствительности данной клеточной линии к антипролиферативному действиюинтерферона. Таким образом, даннаялиния представляет интерес в изучениимеханизма антипролиферативного дейст вия интерферона. Штамм лимфоидной клеточной линии че 30,ловека Ношо Яарепз ВСКК(11) У 153 Д, используемый в качестве тест-объектадля изучения действия мутагенных,лекарственных и вирусных препаратов.