Способ выделения двухферментного биокатализатора для получения нуклеозидов

(51)5 С 12 й 9/22 И ПАТЕНТУ прототипа: т без преди заполня,4 ее дианке предв (1 см) "и наполнением в коло одслаивают тонкую УДАРСТВЕ ННЫЙ КОМИТЕТИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗОБР(71) Новосибирский государственный университет им, Ленинского комсомола (72) В.И.Ямковой(73) Новосибирский государственный университет им. Ленинского комсомола (56) Скоупс Р. Методы очистки белков. - М.: Мир, 1976, гл, 5.Василенко С.К., Райт В.К, Методвыделения высокоочищенной рибонуклеазы из яда среднеазиатской кобры. - Биохимия, 1975, т. 40, М 3, с, 578-583. Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для выделения ферментов-фосфодиэатеразы и 5 -нуклеотидазы из ядв кобры с целью производства с их помощью нуклеозидов,Известен способ выделения фосфодиэстеразы и 5-нуклеотидазы иэ яда кобры, осуществляемый путем диализа раствора 1,5 г яда с последующей гель-фильтрацией диализата на колонке (Зх 117 см) с сефадексом 0-75 (еверхмелким), при этом диализ идет 18 часов, гель-фильтрация 35 ч (скорость элюции 6,9 мл/час) 11. Выход фосфодиэстеразы 70/,; удельная активность в 2-х ферментном биокатализаторе 5 -нуклеотидаэы равна 1350 ед/мг белка, фосфодиэстеразы - 220 ед/мг белка. Недостатки: невысокий выход лимитирующего фермента - фосфодиэстеразы. длительность процесса.Целью изобретения является увеличение выхода фосфодиэстераэы и сокращение времени процесса,Ж 1771484 АЗ(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ДВУХФЕРМЕНТНОГО БИОКАТАЛИЗАТОРА ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ НУКЛЕОЗИДОВ(57) Использование: биохимия, очистка белков. Сущность изобретения: очистку лиофилизата яда кобры осуществляют методом колоночной гель-фильтрации на сефадексе 6-75, упакованном в два слоя - верхний основной слой, состоящий из сефадекса марки "сверхмелкий", и нижний вспомогательный слой толщиной не менее 1 см, состоящий из аефадекса с размером частиц 40-120 мкм. 1 табл., 1 фиг.. Поставленная цель достигается предлагаемым способом выделения двухферментного биакатализатора (фосфодиэотеразы и 5 -нуклеотидазы) из яда кобры, по которому очистку буферного раствора сухого яда кобры проводят методом гель - фильтрации на колонке. заполненной сефадексом в два слоя, причем нижний слой имеет толщину не менее 1 см и состоит из сефадекса 8-75 с размером частиц 40-120 мкм, а верхний - толщиной 8,4-9,4 диаметра колонки, состоит из сефадекса 6-75 с размером частиц 10-40 мкм.Чертеж поясняет предлагаемый способ,Отличительные признаки от- гель-фильтрацию провод варительного аиализа;.- колонку для гель-фильтрац ют гелем на высоту, равную 8.4 метров;1771484 40 Выделение ферментов из яда кобры душку" из крупного сефадекса 6-75 (с диаметром гранул 40-120 мкм).Предлагаемый способ иллюстрируетсяпримерами,П р и м е р 1. Выделение фосфодиэстеразы и 5-нуклеотидаэы проводят при 4-6 С.1,5 г сухого яда кобры растворяют в 20 млбуфера А (0,05 М трис-сукцинат, рН 5,6) инаносят на колонку.К 50/60 (Рйаппаса,Швеция), заполненную на 47 см(1:9,4) сефадексом 6-75 (сверхмелким), наслоенным на1 см "подушку" иэ сефадекса 0-75 с диаметром гранул 40-120 мкм, уравновешеннуюбуфером А. Элюцию осуществляют буферомА со скоростью 24 мл/час. Во фракциях,собираемых каждые 15 мин определяют,активность фосфодиэстеразы и 5-нукле. отизады по методу (1). Фракции 32-39, со;держащие элюирующиеся совместнофосфодиэстеразу и 5-нуклеотидазу, объе.диняют(объем 48 мл), измеряют в них содержание ферментов и белка (см. таблицу) иконцентрируют диалйзом против 50 ф глицерина или лиофилиэуют,, П р и м е р 2. При соблюдении условийпримера 1 заполняют на 42 см (1:8,4). Выходцелевых объектов аналогичен примеру 1.П р и м е р 3, При уменьшении высотызаполнения до 41 см (1:8,2) и соблюдениидругих условий по примеру 1 снижается степень очистки ферментов на 10 ф.П р и м е р 4, При увеличении высоты до:48 см (1:9,6) выход ферментов снижается на5 , степень очистки сохраняется аналогично примеру 1,П р и м е р 5, При соблюдении условийпримера 1 "подушку" наслаивают толщиной1,5 см, Результаты аналогичны примеру 1,П р и м е р 6. Декарибоадейиловуюкислоту (рА)10 инкубировали с двухферментным биокатализатором, выделенным изяда кобры, как описано в примере 1. Реакцию.проводили в объеме 0,5 мл при комнатной температуре, в течение 5 мин.Концентрации компонентов полученной реакционной смеси: (рА)ю - 5,0 ае 26 о/мл; трис-НО-буфера (рН 8,5) - 0,1 М,М 9 С 2-.5 мМ, биокаталиэатора,9 мкг/мл,Реакцию останавливали кипячением реакционной смеси в течение 2 мин. Пробу5 анализировали методом микроколоночнойхроматографии (см, чертеж),Как видно из чертежа, за 5 мин гидролизуется 20.7% фосфодиэфирнцх связей субстрата (активность фосфодиэстеразы). За10 это же время 47,7 рА превращается в А(активность 5 -нуклеотидазы).Таким образом, активность содержащейся в двухферментном биокаталиэаторе5-йуклеотидаэц в 2,3 раза выше активности15 фосфодиэстеразы, т,е. лимитирующим ферментом является фосфодиэстераза.Технико-экономические и реимуществаперед.базовым объектом.(1), Указанные отличительные признаки в совокупнОсти с из 20 вестными обеспечивают: увеличение. выхода фосфодиэстеразы до 86, т:.е, в 12,3раза; сокращение времени выделения ферментов с 53 до 10 ч, (т.е. в 5,3 раза); исклю.- чена стадия диалиэа;.а скорость элюции при25 гель-фильтрации увеличивается до 24 мл/ч.Двухферментный биокаталиэатор.содержитв 12,3 раза больше лимитирующего фермен-.та-фосфодизстеразы; что позволяет гидролизовать до нуклеозидов в 12,3 раза большеРНК (ДНК). формула изобретения Способ выделения двухферментногобиокаталиэатора для получения нуклеози 35 дов, включающий очистку буферного раствора сухого яда кобры, о т л и ч а ю щ и й" с я тем, что, с целью упрощения способа и йоаышения выхода по активности, очистку проводят методом гельфильтрации на колонке, заполнейной сефадекеом в два слоя, причем нижний слой имеет толщину не менее 1 см и состоит из сефадекса 6-75 с размером частиц 40-120 мкм, а верхний слой толщиной 8,4-9,4 от диаметра колонки 45 состоит из сефадекса 6-75 с размером частиц 10-40 мкм,.Гагарина, 10 роиз Заказ 3754 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СС 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5