Способ идентификации штаммов гомобазидиальных грибов

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИК 9) П 0 1/68, 1/02, 1/06, 1/34 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ие изоБретЕНИ ОПИС АТЕНТУ(57) Использование: биотехнология, а именно способы определения идентичности мицелиальных культур. Сущность изобретения; способ заключается в скрещивании испытуемых гаплонтов с тестер ными гаплонтами базисного штамма. По результатамобразования дикариотического мицелия с пряжками устанавливают идентичность штаммов, где у видав с биполярной системой несовместимости гаплонты идентичных штаммов имеют частоту скрещивания 50%, а у видов с тетраполярной системой - 250, 2 з,п,ф-лы,39ки им, Н.Г,ХолодногоА.Федоров и С.В,Р и им. Н.Г.Холодного,ч.33, М 1,р,10971978, %16, р,1 ТИФИКАЦИИ. ШТАЛЬНЦХ ГРИБОВ ные ключи дл зработаны,Отсутствие надежных видовых, а тем более штаммоспецифичнцх культуральных признаков гомобазидиомицетов делает актуальным хемотаксономические подходы в систематике этой группы грибов, основанные на определении изоферментных спектров методом гель-электрофореэа.При решении задачи разграничения штаммов гомобазидиальных грибов наиболее близким к изобретению по технической сущности является способ определения изоферментного состава глюкозо-б-фосфат-дегидрогеназы, в частности показаны различия по данному показателю у четырех штаммов сьедобного культивируемого гриба вешенка обыкновенная, Недостатком данного метода является изменчивость иэоферментных спектров грибов, зависящая.от возраста культуры или связанная с проявлением биоритмов различной длительности, что у баэидиальнцх грибов выражает. ся в наличии сезон-специфичных изоформ Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам определения идентичности мицелиальных культур, в частности гомобазидиальных грибов,Определение видовой принадлежности гомобазидиомицетов базируется преимущественно на признаках строения плодового телагрибов. Идентификация культур этих грибов основана на комплексе признаков макро- и микроморфологии, ферментатив- ной активности мицелия (макрохимические цветовые реакции) и линейной скорости роста колонии. Совокупность этих показаталей, однако,.не является н.адежным критерием для разграничения видов базидиальных грибов, обладающих в отличие от других групп грибов достаточно однотипной структурой вегетативного мицелия.Имеющиеся ключи для идентификаций культур некоторых дереворазрушающих афиллофоральных грибов во многих слу-. чаях позволяют провести определение только до рода, или же одно описание соответствует группе близких видов. Аналогич(21) 4756902/13(54) СПОСОБ, ИДЕНМОВ ГОМОБАЗИДИ 771485 АЗ я агарикальных грибов не ранекоторых ферментов, Такая вариабельность изоферментных спектров приводит к тому, что этот показатель чаще используется при установлении границ между отдельными видами, например, в роде Ацапсцз, чем для диагностики штаммов,Целью изобретения является повышение точности идентификации штамма гомобазидиомицета в пределах одного вида.Поставленная цель достигается благодаря тоФу; ите идентификацию основывают на однзнчном взаимодействии гаплоидных мицелиеа,.определяемом экспрессией: штаммоспецифичных аллелей генов системы половой несовместимости, для чего проводят расщепление испытуемого дикариотического штамма на две гаплоидные культуры, осуществляют скрещивание испытуемых гаплонтов с тестерными гаплонтами базисного штамма и по результатам скрещивания, критерием осуществления которого является образование дикариотического мицелия с пряжками, устанавливают идентичность штаммов, где у видов с биполярной системой половой несовместимости гаплонты идентичных штаммов имеют частоту скрещивания 50;, а у видов с тетраполярной системой половой несовместимости гаплонты идентичных. штаммов имеют частоту скрещивания 250.П р и м е р 1; Требуется установить идентичность двух штаммов гомобазидиомицета, имеющего биполярную систему половой несовместимости.Споры из базидиоспорового отпечатка РЫе Иа вег зло Ыез Рг, суспендируют в стерильной водопроводной воде и готовят из нее в малых химических пробирках с 5 мл стерильной водопроводной воды 3-5 последовательных разведений 1:10. Разведенную суспензию базидиоспор высевают по 0,5 мл в чашки Петри на агаризованное пивное сусло (8 по Баллингу, рН 5,5) и равномерно распределяют по поверхности агара микробиологической петлей или шпателем, Через 24 ч чашки помещают под световой микроскоп с объективом х 10 и находят проросшую спору, Убедившись в отсутствии в поле зрения других проросших или непроросших базидиоспор, выводят найденную проросшую спору в центр поля зрения микроскопа и полностью закрывают полевую диафрагму микроскопа, При этом в толще агара высвечивается световой столбик, на вершине которого находится необходимый проросток, Поворачивают в сторону револьвер с объективом и вырезают из чашки агаровый столбик со спорой, обрезанной медицинской иглой с заточенными краями. Диаметр иглы подбирают25 несовместимости, Любая из гаплоидных культур данной группы может быть 30 40 водят расщепление испытуемого штамма на два гаплонта, Для этого мицелий испытуеного жидкого пивного сусла 4 по Баллингу, 45 рН 5,5. Выращивание проводят при 25 С встационарных условиях. Выросшую биомассу отделяют от культуральной жидкости, пе. реносят в стакан гомогенизатора типа 302(ПНР), доводят до контрольной метки сте рильной водопроводной водой и измельчают при 10 тыс, оборотов в минуту в течение 5 мин. Гомогенат содержит фрагменты мицелия длиной не более 500 мкм, состоящие из нескольких клеток гифы. Полученный го могенат разводят стерильной водопроводной водой 1:100 и используют в качестве инокулюма (0,5 мл) на 50 мл среды следующего состава, г(л: глюкоза 20,0; глицин 5,0; мясной пептон 10,0, Среду указанного состава стерилизуют в колбах Эрленмейра ем 5 10 15 меньше поля зрения микроскопа, но больше диаметра светового пучка при закрытой полевой диафрагме. Возвращают объектив в исходное положение и контролируют точность вырезания споры. Медицинскую иглу подсоединяют к стерильному шприцу и выдувают агаровый столбик с проросшей спорой в чашку Петри со свежей сусло-агаровой средой. На одну чашку помещают около десяти выделенных спор. Выросшие колонии микроскопируют и те, которые не имеют пряжек, отсевают на скошенный агар в пробирки. Отбор комплементарных гаплонтов проводят на сусло-агаровой среде в чашках Петри, размещал тестируемые пары гаплонтов на расстоянии 2 см друг от друга, В случае мицелиального контакта двух колоний через 7 - 10 сут микроскопируют мицелий, образующийся в зоне контакта, и при наличии пряжек отмечают такие кроссы как положительные (табл, 1).Выявленные группы гаплонтов противоположного типа спаривания маркируют (произвольно) как группу с А 1 и А 2 фактором тест-культурой для сконструированного дикариона. Например, для дикариона, составленного из гаплонтов 2 и 7, отличающегося среди других дикарионов наибольшей целлюлазной активностью, в качестве тесткультур данного дикариотического штамма могут выступать не только гаплонты 2 и 7, но и другие гаплонты, несущие А 1 и А 2 факторы половой несовместимости,Для установления идентичности дикариотического штамма Р. тепзтоЫез 27(составлен из гаплонтов 2 и 7) с другим дикариотическим штаммом этого вида промого штамма вносят в колбы Эрленмейра емкостью 0,5 л, содержащие 0,15 л стериль 1771485костью 0,5 л 15 мин при давлении пара 0,1 мПа. По мере роста глубинных шариков мицелия периодически проводят микроскопирование краевых гиф мицелия на наличие пряжек. Через 7 - 10 сут выращивания на качалке, когда мицелиальные шарики достигнут размера 2-4 мм и большинство иэ них не будет иметь краевых дикариотических гиф, биомассу отделяют от среды и проводят повторную гомогенизацию в указанном выше режиме. Полученный гомогенат разводят стерильной водопроводной водой 1;10 и высевают по 0,5 мл на агариэованное пивное сусло в чашки Петри. Выросшие колонии проверяют под микроскопом на отсутствие пряжек и отсевают в качестве испытуемых гаплонтов, Один иэ произвольно выделенных гаплонтов скрещивают с 5-6 другими гаплонтами или с большим числом до тех пор, пака не обнаружится комплементарный гаплонт, Формирующий дикариотический мицелий. Отобранные два комплементарных гаплонта испытуемого штамма скрещивают с тестерными гаплонтами базисного штамма. Если частота скрещивания между ними равна 50 ОД, то сравниваемые дикариотические штаммы идентичны. При всех других значениях частоты скрещивания дикариотическиештаммы имеют различное происхождение (табл. 2).П р и м е р 2. Требуется установить идентичность двух штаммов гомобазидиомицета, имеющего тетраполярную системуполовой несовместимости.Выделяют гаплонты Рецговз озтгеа 1 оз (Рг,) Катят. из базидиоспор, как зто описано в примере 1. Для выделения тестерных гаплонтов производят скрещивание 14-16культур, выделенных из баэидиоспор, как это описано в примере 1 (табл. 3),Выявленные группы гаплонтов противоположного типа спаривания маркируют (произвольно) как группы с А 181, АгВ 2, А 1 В 2и А 2 В 1 факторами несовместимости. В каждой группе из четырех типов спаривания выбирают одну гаплоидную культуру в качестве тестерной. Например, выбраны гаплонты.З, 6, 5, 12 и из первых двух составлендикариотический штамм 36.Для установления идентичности дикариотического штамма 36 с другим дикарио 30 35 40 50 5 10 15 20 25 тическим штаммом этого вида производят расщепление испытуемого штамма на два комплементарных гаплонта, как это описано в примере 1. Эти два гаплонта скрещивают с тестерными гаплонтами базисного штамма. Если частота скрещивания между ними равна 25 фД, то сравниваемые дикариотические штаммы идентичны. При всех других значениях частоты скрещивания дикариотические штаммы имеют различное происхождение (табл. 4).Таким образом, предлагаемый способ идентификации штамма гомобаэидиальных грибов может быть реализован на основе общепринятых микробиологических приемов обращения с культурами грибов, причем экспрессия уникальных генов системы половой несовместимости скрещиваемых гаплонтов определяется по морфологическому маркеру на гифах мицелия (пряжке) методом световой микроскопии,Практическая реализация изобретения создает основу для решения проблем правоохранности объекта при внешнеторговой реализации лицензии и осуществлении авторского надзора за штаммом гомобаэидиального гриба. Формула изобретения 1, Способ идентификации штаммов гомобаэидиальных грибов, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения точности идентификации штамма в пределах одного вида, получают тестерные гаплонты из базисного штамма, выделяют гаплонты иэ исследуемого штамма, скрещивают полученные гаплонты и идентифицируют штамм по частоте скрещивания гаплонтов, которую выявляют по наличию пряжки у дикариотического мицелия,2. Способ по и. 1, о т л и ча ю щ и й с я тем, что при идентификации штаммов с биполярной системой несовместимости идентифицируют исследуемый штамм как идентичный базисному штамму при частоте скрещивания гаплонтов 50 .3. Способпоп.1,отличающийся тем, что при идентификации штаммов с тетраполярной системой несовместимости идентифицируют исследуемый штамм как идентичный базисному штамму при частоте скрещивания гаплонтов 25 %,1771485 Таблица 1 е е веюВвеюВеюеюВею ееаее6 7 8 1 3 4 7 6 5 2 6ю ю е вв е 2 )1(1 Ь АБ е мицелий с пряжками;дикариона не Т а б л и ц а 2 ю Вв ев Ытамм имеетобе аллели,отличающиесяот базисного Итамм имеетодну общуюаллель сбазисным штамм, иден тичный с базисныме ю е ю е е ю ее ю ве е е а А Яуф ав е е вв ев е е е Тестерные гаплонтыбазисного дикариона шт.2 А шт.7 АЧастота скрещивания 1003 75 Ф 50 А - Фактор системы половой несовместимости, .циФра обозначаеталлельность;"-" - культуры несовместимы, контакт .гиФ и образование дикарионане происходите + + е ю + е + + + ава +е + Выявление комплементарных гаплонтов у Р.шегхввоЫез+вава е е ев ев ввисходная таблица скрещиваний восьми гаплонтов;преобразованная таблица скрещиваний;культуры совместимы, образуется дикариотическийк 1 льтуоы несовместимы, контакт гиФ и образованиепроисходит,Варианты скрещивания тестерных гаплонтов базисного дикариона РЫеЫа шегьвпвоЫез с гаплонтами дикарионов, имеющих различные аллели спаривания 52 А6134 А78ыявление комплементарных гаплонтов Р,овсгеасцв 2 51Эе АВ 12тт "+" - культуры совместимые; "-" -культуры несовместимые Таблица 4 Варианты скрещивания тестерных гаплонтов базисного дикариона Реогошз озтгеамз с гаплонтами дикарионов, имеющих различные аллели спаривания"+" - культуры совместимы, образуется дикариотический мицелий с пряжками;"-" - культуры несовместимы, контакт гиф и образование диканриона не происходи Редактор Г, Бель аказ 3754 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ ССС 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 10 2 + 6 + А,В 8 + 10 + 13 + 1А 20 4 11 14 5