Способ определения функциональной активности альвеолярных макрофагов у больных туберкулезом

.АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ОПИааай собности клеток к нзии добавляют трипанового сиДля оценки жизнеспо 0,05 мл клеточной суспе 0,05 мл 1-ного раствора ГОСУДАРСТВЕННфЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(56) Грачева М.П. Определение бактерицидной силы альвеолярных макрофагов с помощью МСТ-теста, - Микробиол. зпидемио иммунол. 1984, М 1, с. 87 - 88,(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ АЛЬВЕОЛЯР. НЫХ МАКРОФАГОВ У БОЛЬНЫХ ТУБЕРКУЛЕЗОМ(57) Изобретение относится к медицине. а именно к физиопульмонологии, и может Изобретение относится к медицине, аименно к физиопульмонологии, и может быть использовано в легочно-терапевтических стационарах и поликлиниках практических противотуберкулезных учреждений для определения функциональной активности альвеолярных макрофагов.оЦель изобретения - упрощение способа.Способ осуществляют следующим образом.Мононуклеары и полинуклеары выделяют из 2 мл цельной крови, стабилизированной гепарином (50 ед/мл) и разведенной питательной средой % 199 в отношении 1;1,Полученные 4 мл наносят нп двойнойградиент плотности растворов фикола с верографином: нижний слой (3 мл) с плотнопю.ЫЬо 1 741 077 А 1 быть использовано. в легочно-терапевтических стационарах практических противотуберкулезных учреждениях для определения . функциональной активности альвеолярных макрофэгов у больных туберкулезом. Цель изобретения - упрощение способа. Берут кровь у здоровых и больных туберкулезом легких, выделяют мононуклеары и полинуклеары и по увеличению коэффициента стимуляции убитой культурой БЦЖ в тесте восстановления нитросинего тетразолия определяют высокую, а при снижении по сравнению со здоровыми низкую функциональную активность альвеолярных макрофагов, Предлагаемый способ имеет равную точность в сравнении с прототипом и позволяет исключить бронхоскопию с забором 3 бронхоальвеолярного смыва. стью 1,119 г/см и верхний (3 мл) - 1,077 г/см и центрифугируют 45 мин при 30 при3комнатной температуре. После центрифугирования на границах раздела растворов появляются два кольца: нижнее составляет полиморфноядерные лейкоциты (99-100), верхние - мононуклеары, среди которых содержание моноцитов достигает 15-20, а число полинуклеаров не превышает 2,Каждый слой клеток отсасывают пастеровской пипеткой и 1 раз отмывают физиологическим раствором в соотношении 1:10. К полученному клеточному осадку добавляют 1 мл от раствора и тщательно суспендируют.него и инкубируют при комнатной температура не больше 1 мин. Для подсчета клеток к 0,05 мл суспензии приливают 0,05 мл 0,1 -ного раствора метиленового синего и инкубируют 15 - 20 мин, Оценку жизнеспособности и подсчет количества клеток проводят в камере Горяева.Постановку теста восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-теста) осуществляли в 2 этапа - для нативных клеток (спонтанный НСТ-тест и после стимуляции убитой культурой вакцины Кальметта и Герена (БЦЖ) .(стимулированный тест). Все этапы, начиная.с забора крови, проводят в силиконированной посуде.Для каждого вида клеток в 2 параллельные пробирки помещают объем взвеси, содержащей около 0,5 10 клеток. Однабпробирка служит для постановки спонтанного, другая - для стимулированного теста, В и робу со стимулированным тестом добавляют взвесь 3-недельной убитой культуры БЦЖ в питательной среде М 199, содержащей 108 микробных тел в 1 мл, Объем добавляемой взвеси определяется отношением 1 клетка: 10 микробных тел, Пробирку помещают в термостат при 37 С на 20 ч.Пробирку для спонтанного НСТ-теста центрифугируют в течение 5 мин при 140 д, надосадочную жидкость сливают. а к осадку клеток добавляют 0.2 мл приготовленного одновременно 0,2%-ного раствора нитросинего тетразолия в 0,05 М фосфатном буфере рН 7,4. Пробу помещают в термостат при 37 С на 1 ч, после чего центрифугируют 5 мин при 330, супернатант сливают, к осадку клеток добавляют 0,2 мл диметилсульфоксида. После растворения осадка доводят объем до 3 мл фосфатным буфером 0,05 М рН 7,4, Полученную смесь вновь центрифугируют 10 мин при 330 и в надосадочной жидкости определяют оптическую плотность на Сфпри длине волны 492 нм против контроля на реактивы (2,8 мл фосфатного буфера и 0,2 мл диметилсульфоксида). Результаты выражают в единицах оптической плотности, умноженных на 1000, в пересчете на 10 клеток. Индукцированный тест после 20-часовой инкубации проводят аналогичным образом.Помимо цифровых значений спонтанного и стимулированного НСТ-теста рассчигывали коэффициент стимуляции (КС) как отношение второго показателя к первому,У здоровых спонтанный НСТ-тест с мононуклеарами составлял 33,0 + 4,9, стимулированный 200,1 + 25.3, КС 6,9 + 1,1, с5 1015 2030 35 40 45 50 55 полинуклеарами 56,6 + 4,0, 132,6 + 11,8 и 2,4 + 0,3 соответственно.П ри м е р 1, Больной Х.,32 лет,диагноз: очаговый туберкулез верхней доли правого легкого в фазе инфильтрации, Туберкулез выявлен впервые. Бронхологическое исследование с одновременным исследованием периферической рови произведено на 10-й день со времени поступления в клинику. У данного больного показатель спонтанногоИСТ-теста альвеолярных макрофагов (АМ) составил 44,7, мононуклеаров 56,2, нейтрофилов 35,7, величина стимулированного НСТ-теста была равной 210, 498,7 и.185,7, соответственно, При этом коэффициент стимуляции АМ оказался равным 4,6, мононуклеаров 8,8 и нейтрофилов 5,2,Приведенный пример свидетельствует о том, что при ограниченных формах туберкулеза легких с относительно благоприятным его течением показатели функционального состояния АМ; мононуклеаров и нейтрофилов изменяются однонаправлен- но и характеризуются незначительным повышением спонтанного НСТ-теста привысоких значениях коэффициента стимуляции,Таким образом, у данного больного повышенные значения КС мононуклеаров инейтрофилов периферической крови по сравнению со здоровыми указывали на высокую функциональную активность АМ, подтвержденную проведением у данного больного бронхоскопии и определением НСТ-теста с АМ бронхоальвеолярного смыва.П р и м е р 2.Больная 35 лет, диагноз: инфильтративный туберкулез верхней доли правого легкого в фазе распада (деструктивный туберкулез) МТ+ туберкулез легких выявлен впервые, Бронхологическое исследование с одновременным исследованием крови произведены на 15-й день госпитализации. У больной показатель спонтанного НСТ-теста АМ составил 92,1, мононуклеаров 48,6 и нейтрофилов 86,4, величины стимулированного ИСТ-теста были равны 285,5; 208,9 и 181,4 соответственно. При этом коэффициент стимуляции был снижен и оказался равным для АМ 3,1, мононуклеаров 4,3 и нейтрофилов 2,1,Данный пример свидетельствует о том; что при деструктивных формах туберкулеза легких с относительно неблагоприятным его течением: показатели функционального состояния АМ, мононуклеаров и нейтрофилов также носили однонаправленный характер и отличались высоким уровнем спонтанного НСТ-теста при ограничении резервов сти1741077 Состав Техред ель ВЛитовченко.Морге нтал Корректор А.Ротма едактор М,Циткина акаэ 2083 Тираж Подписное . ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям. при ГКНТ ССС 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 1 муляции. У данной больной низкие значения коэффициента стимуляции мононуклеаров и нейтрофилов периферической крови сами по себе указывали на низкую функциональную активность АМ, подверженных проведением у больной бронхоскопии определением НСТ-теста с АМ бронхоальвео лярного смыва. 8 качестве прототипа выбран способ непосредственного определения спонтанного и стимулированного НСТ-теста в альвеолярных макрофагах, полученных из бронхоальвеолярного смыва. По сравнению с прототипом предлагаемый способ проще, т.е позволяет отказаться от проведения бронхоскопии и бронхоальвеолярного лаважа,Точность обоих способов была одинако- вой (см, таблицу). Формула изобретения Способ определения функциональнойактивности альвеолярных макрофагов у больных туберкулезом легких, включающий 5 инкубацию клеток в присутствии туберкулезного микроба штамм БЦЖ с последующей инкубацией с нитросиним тетразолием и вычислением коэффициента стимуляции его восстановления, о т л и ч а ю щи й с я 10 тем, что, с целью упрощения способа. в. качестве клеток используют мононуклеары и полинуклеары, выделенные из крови больных, и при увеличении коэффициента стимуляции восстановления тетразолия 15 нитросинего у больных по сравнению со здоровыми определяют высокую функциональную активность альвеомерных макрофагов, при коэффициенте стимуляции у больных меньшем, чем у здоровых, определяют низ кую функциональную активность альвеомер. ных макрофагов у больных туберкулезом.