Способ получения посевного материала продуцента аминогликозидного антибиотического комплекса sтrертомuсеs сrемеus suвsр. nевrамсyini

(19 2 Р 19/5 ЕНИЯ ски аль. това од анГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ПИСАНИЕ ИЗОБР ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(56 Лабораторный регламент на проиство тобрамицина сульфата, - М,: ВНИтибиотиков, 1983.йуг., .еп 9 уе Е, Асса щсгоЬо. -Яс. Нцп 91959, ч. 6, р. 171-177,(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОСЕВНОГО МАТЕРИАЛА - ПРОДУЦЕНТА АМИНОГЛИКОЗИДНОГО АНТИБИОТИЧЕСКОГО КОМПЛЕКСА ЗТВЕРТОМУСЕЗ СЯЕМЕОЯ ЯОВЯР, КЕВВАМУСМ Изобретение относится к микробиологической и медицинской промышленности, в частности к способу получения аминогликозидного антибиотического комплекса, состоящего из карбамоилтобрамицина (тобрамицин - медицинский препарат, представляет интерес в химиотерапии инфекций, обусловленных грамотрицательными бактериями, в том числе Рз. аегц 9 поза), карбамоилканамицина и апрамицина (применяется в ветеринарии при лечении желудочно-кишечных заболеваний крупного рогатого скота и свиней),Известен способ получения посевного материала, когда вегетативный посевной материал культуры Ятгертовусез сгегпецз зцЬзр. пеЬгаглуси выращивается на посевной среде следующего состава, мас,%; кукурузный экстракт 2,0; глицерин 2,0;(57) Использование: в микробиологической и медицинской промышленности при получении аминогликозидного антибиотического комплекса, состоящего из карбамоилтобрамицина, карбамоилканамицина и апромицина, Сущность изобретения: вегетативный инокулят выращивают в жидкой питательной среде в течение 24 ч при перемешивании и аэрации с последующим отбором кондиционного материала по морфологической характеристике культуры, рН среды и дегидрогеназной активности мицелия, Увеличение содержания антибиотиков в культуральной жидкости на ЗОО достигается посредством использования на стадии ферментации вегетативного инокулята, обесцвечивающего раствор метиленовой сини.в течение 1-2 мин при рН среды 7,2-7,5 и имеющего морфологию в виде отдельных сплетений гиф. 1 табл. хлористый аммоний; хлористый натрий 0,3; мел 0,5; животный жир 0,75,Посевной мицелий к моменту передачи на стадию ферментации должен удовлетворять следующим требованиям; рН 5,5-7,0; внешний вид культуры: мелкий мицелий, заполняет весь объем пробы, при стоянии мицелий не оседает. Микроскопическая характеристика мицелия; в препарате, окрашенном метиленовым синим, наблюдаются короткие. слабоветвящиеся, базофильные гифы.Недостатком известного способа является низкая антибиотическая активность культурэльной жидкости в конце ферментации.Цель изобретения - увеличение антибиотической активности культуральной жидкости, что приведет к снижению себестоимости антибиотиков тобрамицина и апрэмицина,хло истый натрий 0,3; мел 0,5; водопроПоставленнаяцельдостигаетсятем,что 0,2;хлор рН с е ы 74+0 при выращивании вегет твегетативного инокулята водная вода остальное; р р д, +О, .иалН 6,0), не содеропределяют ддегидрогенаэную активность Посевной материал (р, ),елия и тем обесцвечивания раствора жащий постороннеимикр ф р,ик о ло ы, имеющийний ви; мелкий мицелий, заполняет метиленовой сини и при обесцвечивании в 5 внешнии вид;( Н е ы 7,2-7,5)и наличии весь объем пробы, при стоянии не оседает. течение 1-2 мин (р средыя ха акте истика: в преот ельных сплетений гиф отбирают конди- Микроскопическая х р р отдельных сплетпарате, окрашенном метиленовым синим,я ко откие слабоветвящиеся,В известном способе физиологическое наблюдаются к рл ы Зггерсовусез г 1 возцз, 10 базофильныегифы вколичестве 2% отобьсостояние культуры гепо окислительно-восстановительной(дегид- при проведении ферментаций при + в) вности мицелия. Дегидро- аппаратах вместимостью 30 л (коэффициент рогеназной) активности м0 5) и в колбах (Чт 50 100 мл срезн ю активность продуцента измеряют заполнения 0,5) и в кол ( по скорости обесцвечивания красителя ме ды; Ч 1 о 0 25 р д )мл с е ы на качалке с числомго, Для культуры оборотов 240 об/мин на среде следующего тиленового синего, Для.: м ка соевая 3,5; животный Баге совусез сгевецз зцЬзр. пеЬгавусЮ состава, мас.: мука с гер11 глюкоза 1,5; хлористый аммоний дегидрогеназная активность, измеренная жир,; глпо известной методике, может быть охарак,6; сернокис лый магний 1,1; мел 0,7; водотеризована временем обесцвечивания 20 проводная вода остальное; рН среды 6,2+ 0,01%-ного раствора метиленовой сини. Ус- +0,1.тановлено, что кондиционный посевной материал имеет дегидрогеназную активность-2 мин. Однако данный параметр не может ральной жидкости определяют методом быть единственной характеристикой конди диффузии в агар с использованием тестзцЬОИз штамм 6633 и выионности вегетативного инокулята, так как культуры ВасНиз те же значения дегидрогеназнои активно- ража ют д цтв е ини ах на 1 мл, Суммарная сти возможны при налиналичии в посевном ма- антибиотическая активность культуральной териале ольшого кб оличества жидкости 2800 мкг/мл для штамма 9871 инной биомассы. Для точного отбо 1400 мкг/мл для штамма 2242. лизированнои иомра кондиционного посевного материала ы а ивание вегетаужно ввести дополнительно еще 2 пара- тивного инокулята проводят на посевной метра: морфология культуры при микроско- среде прототипа в течение р пировании - отдельные сгглетения гиф и рН в колбах на качалке с числом оборотов среды - 7,2-7,5, Только 3 параметра в сово 240 об/мин и в посевном аппарате вместикупности позволяют получить кондицион- мостью 7 л (коэффициент заполнения 0,7) с ный посевной материал, использование числом оборотов 150 об/мин. которого в дальне шем нй ем на стадии фермен- Кондиционность вегетативного инокутации дает максимальную антибиотическую лята определяют 3 параметрами в активность культуральной жидкости, Значе совокупности: морфология при микроскозной активности более 2 пировании - отдельные сплетения гиф, рНти 72 в емя обеснмин свидетельствует о недостаточной зре- культуральной жидкости 7,2; время о есцлости мицелия продуцента, т.е, он будет ма- вечивания 0,01%-ного раствора метиленолопродуктивен на стадии ферментации. вой сини (1 мл раствора + 5 мл Значение дегидрогеназной активности 45 культуральной жидкости) 1 мин,1 е ини ы свидетельствует о силь- Кондиционный посевной материал исв ении фе ментаций в ном автализе культуры, пользуют при проведении ф раппаратах вместимостью 30 л (коэффициП р и м е р 1(по известному способу). В ент заполнения 0,5), в колбах (Чт 50 100 мл качестве объекта исследования используют 50 среды) на качалке с числом оборотов 240 культуру 31 герсовусез сгевецз зцЬзр, об/мин, добавляя его в количестве 5 фот(штаммы 2242, 9871). Вегетатив- объема культуральной жидкости. Ферменный инокулят выращивают при 37 С втече- тациипроводятпри 37 1 Снаф рн е ментациние 24 ч в колбах на качалке с числом онной среде п.рототипа, оборотов 240 об/мин и в посевном аппара Продолжительность ферментации 72 ч. Анте вместимостью 7 л (коэффициент запол- тибиотическую активность культуральной нения 0,7) с числом оборотов мешалки жидкости определяют методом диффузии в150 об/мин на среде следующего состава, агар с использованием тест-культуры мас,%: глицерин 2,0; кукурузный экстракт ВасИцз зцЬтйз штамм 6633 и выражают в 2,0; животный жир 0 75: хлористый аммоний1735366 актибиотической активности культуральнойжидкости на 30%,Суммарная антибиотическая активность к.ж.,мкг/млДегидрогеназная ак-. тивность,мин рН Пример Морфология при микроскопировании1400 2800 6,0 Короткие слабоветвящиеся базофильные гифы Отдельные сплетениябазофильных гифТо же1 1820 3640 7,2 1820 1640 1000 3640 3280 2000 2 21,5 7,5 7,0 7,2 Густая сетка базофильных гиф Отдельные сплетения базофильных гиф Автолизированная сетка базо ильных ги600 1200 10 6.9 500 1000 20 с 5,8 25 Составитель Г. ВострокнутоваРедактор Н, Гунько Техред М.Моргентал Корректор Т, Малец Заказ 1793 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 единицах на 1 мл, Суммарная антибиотическая активность культуральной жидкости 3640 мкг/мл для штамма 9871 и 1820 мкг/мл для штамма 2242.Применение вегетативного инокулята, кондиционность которого определяют по одному параметру (по морфологии при микроскопировании как в случае с прототипом), приводит к потере активности на стадии ферментации в силу использования еще молодого или переросшего посевного материала.Полученные данные по влиянию отдельных характеристик вегетативного инокулята на содержание аминогликозидного комплекса в культуральной жидкости представлены в таблице.Приведенные примеры показывают, что только определение кондиционности посевного материала по 3 параметрам в совокупности приводит к увеличению Формула изобретения 5 Способ получения посевного материала - продуцента аминогликозидного антибиотического комплекса Ятгертощусез сгегпецз зцЬ,Бр, пеЬгагпуси 1, включающий выращивание культуры в жидкой питатель ной среде с последующим отбором кондиционного материала по морфологической характеристике культуры и рН среды, о т - л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью увеличения антибиотической активности культу ральной жидкости, при отборе определяютдегидрогеназную активность мицелия путем обесцаечивания раствора метиленовой сини и при обесцвечивании в течение 1-2 мин, рН среды 7,2-7,5 и наличии отдельных 20 сплетений гиф отбирают кондиционный материал.