Способ идентификации т-хелперов и т-супрессоров

(я)з 6 01 й 33/53 ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ДТОРСКОМУ СИДЕТЕЛСТУ. (71) Киевский медицинский институт имакЪд А.А. Богомольца(56) Ярилин А.А. Чувствительность Т-лимфоцитов человека к теофиллину. Биологическая и клиническая интерпретация. Клеточные факторы регуляции иммуногенеза, Наука, Новосибирск, 1985, с. 24-39, 1,54) СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ Т-ХЕЛПЕРОВ И Т-СУПРЕССОРОВ(57) Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологическим методам исследования, и может быть использовано для Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологическим методам исследования, и может быть использовано в клинической и лабораторной практике для идентификации Т-хелперов и Т-супрессороа.Целью изобретения является ускорение и повышение точности способа.Указанная цель достигается тем, что пробы лимфоцитов параллельно обрабатывают теофиллином и колхицином а конечной концентрации 3 мкг/мл - 7 мкг/мл, после инкубации и отмывания к пробам приливают раствор акридинового оранжевого в разведении 1;30000 и учетом количества Т-хелперов идентификации Т-хелперов и Т-супрессоров при оценке имунного статуса организма в норме и при патологии. Целью изобретения является ускорение и повышение точности, Способ осуществляется путем обработки лимфоцитов параллельно теофиллином и колхицином в конечной концентрации 3 - 7 мкг/мл, инкубации, отмывания с последующей обработкой проб раствором акридиноаого оранжевого в разведении 1;30000, Учет количества Т-хел перов и Т-супрессоров ведут по интенсивности флюоресценции и при активации лимфоцитов колхицином определяЮт Т-хелперы, а при активации лимфоцитов теофиллионом - Т-супрессоры, Способ позволяет оценить физиологическую активность субпопуляий Т-лимфоцитов хелперов, супрессорово активности дезоксирибонуклеопротеид- .ого комплекса. 3 табл,и Т:супрессоров ведут по интенсивности, С флюоресценции проб и при активации, Ч.) ,лимфоцитов колхицином определяют Т- Я хелперы, а при активации лимфоцитов теофиллином - Т-суп рессоры.. аеевйСпособ осуществляют следующим образом.Лимфоциты вравных количествах перед инкубацией с акридиновым оранжевым в ,обрабатывают следующим образом,. Одна проба лимфоцитов служит контролем, другую пробу обрабатывают теофиллином, а третью пробу колхицином в конечной концентрации 3 мкг/млмкг/мл, После инкубации при 370 С и 45 мин пробы отмывают, добавляют акридиновый оранжевый, инку бируют при 4 С 30 мин, после чего центрифугируют и на спектрофлюориметре при А 530 нм (А возбуждения 460 нм) измеряют интенсивность флюоресценции надосадочной жидкости. Количество 5 Т-хелперов и Т-супрессоров определяют по формуле 10 100 -30:5 - 4Т = 100% 20%.5 П р и м е р 2. Все операции с лимфоцитами донора В 2 осуществляют аналогично примеру 1,По формуле вычисляют Т-хелперов и Т-супрессоровгде Ак - количество акридинового оранжевого, связавшегося с лимфоцитами, контроль;Ас - количество акридинового оранжевого, связавшегося с лимфоцитами после обработки их теофиллином;Ах - количество акридинового оранже вого, связавшегося с лимфоцитами после обработки их колхицином.Конкретные примеры осуществления способа.П р.и м е р 1. Из исследуемой крови донора М 1 выделяют на фиколл-уротрасте лимфоциты, которые в равных количествах вносят в 3 пробирки, Лимфоциты первой пробы служат контролем, к ним приливают 2 мл физиологического раствора, Лимфо циты второй пробы обрабатывают теофиллином, лимфоциты третьей пробы - колхицином, в конечной концентрации 3 мкг/мл - 7 мкг/мл, Оптимальной дозой колхицина является концентрация 4 мкг/мл. Общий объем каж дой пообы доводят до 2 мл физиологическим раствором, После инкубации проб при 37 С в течение 45 мин лимфоциты отмывают от реагентов при 1500 об/мин в течение 10 мин и к лимфоцитам в первоначальном 40 объеме 2 мл приливают 2 мл раствора акридинового оранжевого. Пробы инкубируют 30 мин при 4 С, затем центрифугируют и в надосадочной жидкости определяют интенСивность флюоресценции в контрольной и опытных пробах. Разность величин флюоресценции раствора акридинового оранжевого и контрольной пробы, а также опытных проб дает представление о количестве связавшегося акридинового оранжевого.По формуле вычисляют количество Т-хелперов и Т-супрессоров Тх =100% 35,7%7 - 6Тс - 7100 14,4,В работе было обследовано 14 доноров, Результаты, полученные предлагаемым способом, сравнивали с результатами, пол- ученными методами теофиллиновых розеток и с помощью моноклональных антител (фирма "Соое 1 сг", США).Результаты представлены в табл,3.Таким образом, результаты, полученные предлагаемым методом, приближаются к результатам, которые были получены методом моноклональных антител, так как между ними не было достоверных различий. Не было достоверных различий и в количестве Т-супрессоров, определенных методом теофиллиновых РОК. Однако в количестве Т-хелперов такие различия имели место (р 0,01), что указывает на повышение точности результатов.Формула изобретения Способ идентификации Т-хелперов и Т-супрессоров, включающий обработку лимфоцитов теофиллином путем инкубации, отмывания с последующим учетом количества Т-хелперов и Т-супрессоров, о т л и ч аю щ и й с я тем, что, с целью ускорения и повышения точности способа, параллельно пробу лимфоцитов обрабатывают колхицином в конечной концентрации 3 мкг/мл - 7 мкг/мл, затем раствором акридинового оранжевого в разведении 1:30000 и учет количества Т-хелперов и Т-супрессоров ведут по интенсивности флюоресценции. и при активации лимфоцитов колхицином определяют Т-хелперы, а при активации лимфоцитов теофиллином - Т-супрессоры.1709221 Таблица 1 Табл Т цаРазличия достоверн оставитель Б. Мануйлоехред М.Моргентал Редактор Ю. С р Н, Ревск Ко Заказ 422 Тираж ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открыти113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 и ГКНТ СССР Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 101