Способ первичного скрининга химических соединений на иммуномодулирующую активность

.Ю 170408 51)5 0 33 53 ОСУДАРСТВЕН.)ЫЙ КОМИТЕТПО И 9 ОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ 1 Ф 1дицинский институтД.К.Новиков и Е.А.Улано детельство СССР 1 В 1 О/10, А 61 К 39/О Кирилличева Т.Б, Способ дуляторов,РВИЧНОГО СКРИНИНГА ОЕДИНЕНИЙ НА ИММУЩУЮ АКТИВНОСТЬ относится к медицине и льэовано как первичный и при поиске новых иммумедицин(54) СПОСОБ ПЕХИМИЧЕСКИХ СНОМОДУЛИРУЮ(57) Изобретениеможет быть испоскрининговый эта Изобретение относится к е, в частности к иммунологии,Целью изобретения является упрощение и ускорение первичной фармакологической оценки химических соединений в качестве иммуномодуляторов.Способ осуществляется следующим образом.Проводят оценку эффекта тестируемых препаратов на способность стимулировать или подавлять розеткообразование лимфоцитов доноров в активном тесте с эритроцитами барана (Т - активные лимфоциты, Та) по сравнению со стандартными иммуномодуляторами. Для этого на первом этапе реакции подбирают оптимальную нетоксичную для клеток, концентрацию препарата, Исследуемые препараты нотропных препаратов. Цель изобретения - упрощение и ускорение поиска средств, обладающих потенциальной иммуномодулирующей активностью, путем оценки реакции лейкоцитов крови на испытуемое средство. Цель изобретения достигается тем, что после предварительного определения нетоксичных для клеток концентраций препаратов оценивают их эффект на рецепторы лимфоцитов периферической крови доноров в тесте активного розеткообразования по сравнению со стандартными иммуномодуляторами, и при стимулирующей активности на розеткообразование, равной по степени эффекта левамизолу, или угнетающей, равной гепарину, средство относят к иммуномодуляторам. растворяют в изотоническом растворе хлористого натрия в различных разведениях и ставят реакцию лейколизиса, для чего получают лейковзвесь из крови здорового человека, взятой в количестве 15-20 мл на 2,7;4 Йа 2 ЭДТА, Клетки трижды отмывают раствором Хенкса и ресуспендируют в этом же растворе в концентрации 4-5-х 10 кле 6 ток/мл. Затем смешивают в пробирке о равных объемах взвесь лейкоцитов и разведения испытуемого вещества, и:кубируют 20 мин при 37 С, центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 мин, надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 1-2 капли трипанового синего с эозином, использчемогодля оценки жизнеспособности лейко. цитов, ресуспензируют и подсчитывают количество окрашеннь х клеток на 100 лейко1704084 После определения рабочих концентраций препаратов тестируют их эффект на количество Т-лимфоцитов 3-х доноров, одновременно оценивая чуестви тельность этих клеток к стандартным иммуномодуляторам, в качестве котоых используются левамиэол (10 М, 10 М) как иммуностимулятор и гепарин (10 ЕД/мл, 50 ЕД/мл) как средство с им мунодепрессорными свойствами. Отмытые от плазмы лейкоциты крови разводят рабствором Хенкса до концентрации 2 - 3 х 10 /мл. Смешивают в равных объемах (по 0,1 мл лейкоциты с тестируемыми препа ратами в лунках планшет для иммунологических реакций (каждую пробу дублируют) и инкубируют в термостате при 37 С 30 мин, Контролем служат лейКоличество Та лимфоцитов (среднее от З.х доноров) в контроле . Число Тв в опыта х тоотфИИР" Количество Та в контроле 30 Индекс иэменения роэеткообраэования не тестируемый препараткэИндекс иэмснення роэетк;эбраэовадия на стандартный иммуномодулятор цитов в камере Горяева, Для работы отбирают наименьшие разведения препарата, не оказывающие повреждающего действия на клетки (жизнеспособность клеток не менее 95 ь). коциты, аналогично инкубированные всреде. Затем сравнивают эффект средств, обладающих стимулирующим действием на розеткообразование. с лееамизолом, а средств, обладающих угнетающим действием, - с гепарином. Для этого выЕсли эффект тестируемого препарата составляет не менее 707 ь от эффекта стандартного иммуномодулятора (КЭ 707 ь), его Относят к потенциальным иммуномодуляторам.Тестировали на наличие иммунотропной активности следующие препараты: мезатон, соединения рения пл 2 и М 5. Тестируемые препараты и препараты сравнения (гепарин и левамизол) в день постановки реакции растворили в иэотоническом растворе хлористого натрия, Приготовили последовате 7 льные раэеедения тестируемых веществ 10 - 1 М. Процесс тестирования состоял из двух этапов, На первом этапе определяли рабочие концентрации препаратов, Брали по 20 мл крови на 2,76 раствора ЭДТА у 3-х здоровых лиц. Получали лейкоеэвесь путем отстаивания крови е течение 45 мин. После инкубации планшету центрифугируют на центрифуге со специальными держателями при 1000 об/мин в течение 5 мин (при отсутствии такой центрифуги реакцию можно осуществлять е пробирках). Надосадочную жидкость удаляют пастеровской пипеткой, к осадку добавляют 0.1 мл раствора Хенкса и 0,1 мл суспенэии эритроцитов барана (концентрация клеток 1-2 х 10 /мл), инкубируют при 37 оС в течение 15 мин, центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 мин, надосадочную жидкость удаляют. а осадок ресуспендируют в 2-3-х каплях 0,06-ного раствора глютарового альдегида и делают мазки на предметных стеклах. Мазки фиксируют этанолом. окрашивают азур-эозином и подсчитывают в микроскопе с помощью иммерсии количество розеткообразующих на 100 лимфоцитов, принимая за розетку лимфоцит, прикрепивший три и более зритроцитов. Таким образом оценивают эффект препаратов на Т-лимфоциты не менее 3-х доноров и рассчитывают для каждого препарата индекс изменения роэеткообразования (ИИР); числяют степень различия между изменениями Та лимфоцитов, вызываемыми тестируемыми и стандартными иммуномодуляторами, так называемый коэффициент эффекта (КЭ): Лейкоциты отмывали трижды раствором Хенкса и ресуспензировали в этом же растворе дб концентрации 4 - 5 х 10/мл. Смешивали в пробирках е равных объемах (по 0,1 мл) суспенэию клеток и испытуемый препарат (в контроле 0,1 мл клеток и 0,1 мл раствора Хенкса), Смесь инкубировали 20 мин при 37 С, а затем центрифугировали при 1000 об/мин в гечение 5 мин. Надосадочную жидкость сливали, а к осадку добавляли 1-2 капли 0,16-ного раствора трипанового синего, используемого для оценки жизнеспособности лейкоцитов, Ресуспензировали и подсчитывали количество окрашенных (мертвых) клеток на 100 лейкоцитов в камере Горячева.Суммируя результаты экспериментов с лейкоцитами 3-х доноров выбирали наименьшие разведения препаратов, не оказы. веющие поереждающего действия ма 35 40 45 501704084 5 10 15 20 Формула изобретения Способ первичного скрининга химических соединений на иммуномодулирующую активность путем оценки лейкоцитов нв испытуемое соединение, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения и ускорения способа. предварительно в реакции Ь чИго определяют нетоксичные концентрации препарата в пробе лейкоцитов периферической крови донора с трипановым синим, далее оценивают активность соединений в этих концентрациях в тесте активного роэеткообразования и при наличии стимулирующей активности препарата на розеткообраэование, составляющей не менее 70 от активности контрольной пробы. содержащей лееамизол, или угнетающей - не менее 70 от активности контрольной пробы, содержащей гепарин, химическое соединение оценивают как иммуномодулятор. 25 30 35 40 Составитель Р.ГуменюкТехред М.Моргентал Корректор С.Шее кун Редактор О.Хрипта Заказ 60 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 Производстеенно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 клетки (жизнеспособность не менее 956), Для препаратов рения М 2 и М 5 такой-4концентрацией были 10 М, мезатона - 10 М,Препараты сравнения применяли в оптимальных концентрациях, которые наиболее эффективно изменяют розеткообраэование лимфоцитов доноров, Такой концентрацией для лееамизола является 10 -10 М, для гепарина - 10 ЕД/мл или 50 ЕД/мл.Вторым этапом было определение эффекта препаратов на роэеткообраэование Та лимфоцитов с эритроцитами барана в активном тесте. Для этого брали по 20 мл крови у 3-х доноров. Выделенные и отмытые от плазмы лейкоциты разводили раствором Хенкса до концентрации 2-3 х 10 /мл. Смешивали в равных объемах (по 0,1 мл) лейкоциты с тестируемыми препаратами в лунках планшет для иммунологических реакций и инкубировали в термостате при 37 С в течение 30 мин. В качестве контроля испольэовали лейкоциты, аналогично инкубированные в среде. Все пробы ставили в трех параллелях. После инкубации планшеты центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость удаляли пастеровской пипеткой, а к осадку добавляли 0,1 мл раствора Хенкса и 0,1 мл суспензии эритроцитов барана (концентрация эритроцитов 1 "2 х 10 кл/мл), инкубировали при 37 С в течение 15 мин, центрифугировали при 1000 об/мин в течение 5 мин. Осадок ресуспендируют в 2-3-х каплях 0,0 б-ного раствора глютароеого альдегида и делали мазки на предметных стеклах, После высыхания мазки фиксировали этанолом 10 мин, окрашивали азур-зозином и подсчитывали под иммерсией количество розеткообразующих клеток на 100 лейкоцитов.Вычисляли средний процент Т-лимфоцитое у этих донорое и рассчитывали для каждого препарата ИИР. Затем сравнивали эффект средств. обладающих стимулирующим действием на розеткообразоеание, с лееамиэолом, а средств, обладающих угнетающим действием, - с гепарином. Препараты рения 1 Ф 2 и М 5 обладают стимулирующим эффектом, поэтому КЭ для них рассчитывали по отношению к левамизолу, а мезатон снижает роэеткообразовзние (препарат сравнения - гепзрин). Лищь один иэ препаратов (рений 1 Ф 5) имеет КЭ 84, т.е. его эффект составляет более 70 от эффекта стандартного иммуномодулятора, Следовательно. среди тестируемых средств только препарат рения Ю 5 обладает иммунотропной активностью.Предлагаемый способ высоко чувствителен, прост в исполнении и позволяет быстро и эффективно произвести отбор среди препаратов различных групп средств с потенциальной иммунотропной активностью.