Способ количественного определения ауксинов и цитокининов в растительном материале

(51)5 6 01 й 30/06 ГОСУДАРСТВЕ)+1 ЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ АВТОРСКОМУ С ТЕЛЬСТВУ Пробу экстраанолом и этапределяемые ия пробы че. Затем выединения на с обращеннояют их молярние относится к ана частности к количест регуляторов роста рас экстрактах, и может химических, биохими ких исследованиях дл логических объектах а литичеен ному тений в быть исческих, я опре- уксинов ния - повышение чувсторение и упрощение оптогормона в исход риале рассчитываю тся следующим общест стительный материал фиксизотом, растирают и добавля)аАк(71) Институт молекулярной генетики АН СССР(54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АУКСИНОВ И ЦИТОКИНИНОВВ РАСТИ ТЕЛ Ь Н ОМ МАТЕ РИАЛ Е Изобрете ской химии, в определению растительных пользовано в физиологичес деления в био и цитокининоЦель изоб вительности, ределения.Способ ос разом.Свежий р руют жидким(57) Изобретение относится к- аналитиче-. ской химии, в частности к количественному определению регуляторов роста растений в растительных экстрактах, и может использоваться в химических, биохимических., физиологических исследованиях для определения в биологических объектах ауксинов и цитокининов. Целью изобретения является повышение точности и ускорение определения. Свежий растительный материал фиксируют жидким азотом, растирают и добавляют меченые тритием аналоги, Пробу экстрагируют последовательно н-бутанолом и этанолом и концентрируют определяемые соединения йутем пропусками: через патрон с амберлитом ХАД, Затем выделяют индивидуальные соединения на хроматографической колонке с обращенно- Б фазным сорбентом и определяют их молярную активность. 1 з.п, ф-лы, 2 табл,ют меченые тритием аналоги.гируют последовательно н-бутнолом и концентрируют осоединения путем пропусканрез патрон с амберлитом ХАДделяют индивидуальные сохроматографической колонкефазным сорбентом и определную активность.Количество фирастительном матеформуле:где А - молярная активность исходного Нз меченого фитогормона;А, - молярная активность выделенного фитогормона;а - количество добавленного Н-мече 3 ного фитогормона;х - количество эндогенного фитогормона.Количество индХвВдуалного фитогормона, выделяемого на.стадии высокоэффективной хроматографии определяют по площади пика, используя Уф-детектор (длина волны 254 нм). Радиоактивность определяют с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика (эффективность регистрации трития около 30 6).П р и м е р 1, Определение количества 6-бензиламинапурина (БАП) и кинетина в растительной ткани.10 г свежей биомассы (листья, стебли 2-недельного растения) фиксировали жидким азотом, тщательно растирали, количественно переносили в колбу с помощью 80-ного этанола и добавляли меченый тритием БАП ( 1,6 мКи, 17,7 Ки/ммоль) и кинетин (1,23 мКи, 8,97 Ки/ммоль). Объем довели до 100 мл 807 ь-ным этанолом и инкубировали при комнатной температуре в течение 4 ч на магнитной мешалке. Спирт слили, к биомассе добавили еще 100 мл 80%-ного этанола и оставили экстрагироваться на ночь. На следующий день объединили спиртовые экстракты и центрифугировали при 5000 об/мин в течение 15 мин, Супернатант слили в колбу для выпаривания (потери меченого БАП составила 10). Супернатант упаривали до половины исходного объема, центрифугировали при 5000 об/мин в течение 10 мин. Радио- метрическая проверка показала, что потери зН-БАП нет. Добавили 4:1 н-бутаноп (насыц 1 енчый водо) и упарили досуха. Осадок .аствосили в 10 мл 95 -ного спирта (растворяется не весь осадок), перенесли в колбу, добавили 10 мл Н 20 и повторили упаривание с бутанолом, Осадок растворили в 5 мл этанола (950 ), перенесли в колбу и водой довели до 70 . Радиометрическая проверка показала, что потерь на этой стадии нет, С помощью Г 4 аОН довели рН до 8,0, экстрагировали два раза бутанопом в дели- тельной воронке и собрали бутанольные фракции (потеря меченого БАП составила 1,00 ), Бутанольную фракцию упарили досуха, растворили в 1 мп спирта (ОСЧ) и довели объем до 10 мл водой. Этот раствор пропустили через патрон 5 хЗО мм с амберпитом ХАД(Иегова), собрали водную фракцию, цитокиникы смыли с патрона 10 мл 70 спирта (потери метки нет).30 35 40 45 смывали 70%-ным метанолом (потеря 1,0 ).Экстракт упарили досуха, осадок раствори ли в подвижной фазе (0,1 моль/л ТЭАБ. рН7,0 в 40 -ном метаноле), пропустили через патрон с лихропрепом С, С патрона смывали 5 мл той же подвижной фазы (потери зН-ИУК нет). Затем собранные фракции упа рипи досуха и растворили е 50 мкл подвижной фазы.Выделение ИУК проводили на колонкеЯерагоп вах С, 7 мкм (ЧССР). Подвижная фаза 0,1 моль/л ТЭАБ, рН 7,0 с 7% ацетонитрипа, скорость 0,5 мл/мин, УФ-детек 5 10 15 20 25 Спиртовой раствор упарили и к осадку добавили 5 мл 0,1 моль/л триэтипаммоний бикарбонат (ТЭАБ) в 40 -ном метаноле (рН 7,0, подвижная фаза), Пропустили этот раствор через патрон 5 х 30 мм с сорбентом лихропреп С(ЧССР, 25 - 40 мкм). Собрали первую фракцию, смыли еще 5 мл подвижной фазы, объединили и упарили досуха, растворили в 50 мкл подвижной фазы (потери 0,5).Выделение БАП и кинетина проводились на колонке З,Зх 150 мм Яерагоп эах С7 мкм (ЧССР). Подвижная фаза 0,1 моль/л ТЭАБ рН 7,0 в 366-ном метаноле, скорость 0,5 мл/мин, Уф-детектор, А =254 нм. В ремя удерживания БАП 31 мин, кинетина - 14,3 мин.Пики, соответствующие БАП и кинетину, собрали. измерили молярную активность, которая оказалась равной 8,15 Ки/моль в первом случае и 2,18 Ки/моль во втором случае.,Содержание эндогенного БАП и кинетина в исходном растении рассчитывали по приведенной выше формуле.Результаты определения количества БАП и кинетина приведены в табл, 1,П р и м е р 2. Определение количестваиндолил-уксусной кислоты (ИУК), 10 г свежего растительного материалафиксировали жидким азотом и тщательно растирали. Хорошо размельченный порошок перенесли в колбу, добавили Н-ИУКз (0,33 мКи, 6,5 Ки/ммопь), "ОО мл метанола и поместили на магнитную мешалку при 0 С на ночь в темноте, Затем гомогенат центрифугировапи при 10000 об/мин в течение 15 мин . Супернатант слили в колбу для упаривания (потеря меченого ИУК на этой стадии составила 9,5 ) и упарипи досуха Осадок растворили в 70 -ном метаноле, перенесли в колбу, упарипи до водной фазы, рН довели 1 н НС 3 до 3,0 и центрифугировапи ,потери ИУК меченого 2,0 ). Затем супернатант пропустили через патрон с амберлитом ХАД(серва) 5 хЗО мм, Ауксины с патрона1704065 Таблица 1 Таблица 2 тор, Л =254 нм. Время удерживания ИУК - 21,4 мин. Пик, соответствующий ИУК, собрали и определили его молярную активность,Результаты определения количества ИУК в описанном и другом обьектах приведены в табл. 2,Предлагаемый способ позволяет существенно сократить время анализа до суток (почти в 5 раз) за счет сокращения числа стадий хроматографической очистки пробы, упростить и удешевить процесс определения фитогормонов за счет применения менее дефицитных и более дешевых тритиевых аналогов взаменС-аналогов,Способ позволяет работать на первой стадии с малым количеством биомассы, что обуславливает большую чувствительность предлагаемого способа. Увеличение чувствительности связано с значительным сокращением потерь исследуемого материала на всех стадиях процесса и сокращением числа этих стадий. Последнее особенно важно при работе в лабораторных условиях со стерильными растениями, количество биомассы которых ограничено. Формула изобретения 1, Способ количественноо определения ауксинов и цитокининов в растительном материале путем добавления к гомогенату 5 меченых аналогов, экстракции органическим растворителем, предварительной подготовки пробы. хроматографического выделения индивидуальных соединений на хроматографической колонке с обращенно фазным сорбентом и последующим определением их молярной активности, о т л и ч аю щ й й с я тем, что, с целью повышения чувствительности, ускорения и упрощения определения, добавление в гомогенат мече ных аналогов осуществляют до стадии экстракции, а предварительную подготовку пробы проводят последовательной трехкратной экстракцией н-бутанолом и этанолом с концентрированием определяемых 20 соединений.2, Способ по п. 1. о т л и ч а ю щ и й с ятем, что концентрирование определяемых соединений осуществляют пропусканием пробы через патрон с амберлитом ХАДи 25 с обращенно-фазовым сорбентом.