Способ определения танинофильности белков

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 16611 9) 7 КЗ 02 ПИ ИЕ ИЗОБРЕТЕНИ ьскииа 1987 ТАНИН хнолоярной может ГОСУДАРСТВЕ ННЫ И КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯФИЛЬНОСТИ БЕЛКОВ(57) Изобретение относится к биотгии, а именно к биохимии, молекубиологии и биоорганической химии,Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к биохимии, молекулярной биологии и биоорганической химии, и может быть использовано при изучении структуры и функции белков, при исследовании модельных систем полифенолов и белков,Цель изобретения - упрощение и удешевление анализа.Танины - полифенольной природы соединения, найденные в большинстве растительных тканей, обладают способностью связывать и осаждать белки.Способ состоит в том, что используют различные концентрации танина, которые добавляют к исследуемым белковым пробам, с последующим электрофоретическим определением белково-титановых комплексов. быть использовано при изучении структуры и функции белков, при исследовании модельных систем полифенолов и белков, Целью изобретения является упрощение и удешевление анализа, Способ осуществляется следующим образом. Распознавание танинсвязанных белков проводят после добавления различного количества танина в раствор многокомпонентной системы белков, электрофореза в полиакриламидном геле и проявлением белков раствором трихлоруксусной кислоты, Денситометрирование гелей позволяет выявить соотношение танинофильных и танинофобных белков, 2 табл. П р и м е р 1, Из тонко размолотых зерен пшеницы и ячменя берут навеску 500 мг, приливак)т 5 мл 70 О-ной этанола и экстрагируют белок при встряхивании в течение 1 Оч, После центрифугирования при 70009 15 мин надосадоцную жидкость сливают в фар- - ф форовую чашку и упаривают под феном до 1/3 - 1/4 первоначального объема, В полученный раствор добавляют сухую мочевину и сахарозу до 6 М и 20;4 соответственно, и определяют концентрацию белка по связы- ,фф ванию с красителем амида черным 10 Б. По авшюеВ сле этого раствор делят на аликвоты по 200 - 250 мкл и в каждую добавляют танин возрастающих концентраций, ведя расчет на 500 мкг белка: 2, 5, 10, 15, 20, 25 мг танина. В контрольный образец танин не добавляют. После полного растворения танина (30 мин) белки в трехкратной повтор1661182 Таблица Компоненты Количество танина на 500 мкг белка 0 (кон-2 тронь)5 10 20 Субфракцня глиадннапшеницы вогарная 56) 09 9,6 6)7 3,7 21,0 31,7 33,0 34,4 33,3 28,6 30,4 30,6 25,8 29,3 34,0. 28,2 23,6 28,21,2 30)9 28,3 34,7 39,5 29,7 Субфракция гордеина ячменя (Днепровский 435) 37,24,4 16,9 31,9 3,522,0 31,2 59,8 4,7 2,0 7,0 3,8 6,6 45,3 35,8 44,0 27,0 34,1 , 36,6 38,6 24,3 28,4 25,8 20,8 13,8 14,05,6 ности подвергают электрофорезу в 7,5% ПААГ с 6 М мочевины в стеклянных трубках диаметром 5 мм и длиной 80 мм, На трубку наносят 180-200 мкг белка, Первые ЗО мин электрофорез ведут при силе тока 2 мА на 5 трубку и последующие 1,5 ч - при силе тока 4 мА на трубку, После ркончания электрофореза гели опускают в 10%-ный раствортрихлоруксусной кислоты на 1,5 - 2 ч и сканируют на денситометре, Относительное содержа ние белковых субфракций определяют, суммируя площади соответствующих пиков и вычисляя долю каждого из них, приняв сумму за 100%,П р и м е р 2. Из,зерна кукурузы удаляют 15 зародыш, эндосперм размалывают до тонкого порошка и на 1 г муки приливают 10 мл 70%-ного этанола, содержащего 2 М моче- вины. Экстракцию белков проводят в течение 1 ч при 60 С, После центрифугирования 20 при 70000 15 мин надосадочную жидкость упаривают под феном до 1/4-1/5 первоначального объемацобавляют сахарозы до 20%-ной концентрации и определяют белок по связыванию с красителем амидо чернь 1 м 25 10 Б, Танин добавляют в различных количествах, как описано в примере 1.Электрофорез белков проводят в 7,5% ПААГ с 8 М мочевины. Остальная процедура аналогична описанной в примере 1. ЗОП р и м е р 3, Зерносорго размалывают до тонкого порошка, отвешива 1 от 2 г и приливают 20 мл 70%-ного изопропанола с 4 М мочевины, предварительно проведяэкстракцию холодной водой. Еелки солюбилизиру ют в течение 1 ч при 60 С, После иентоиФугирования и упаривания до 1/5- 1/6 первоначального объема в растворы белков добавляют сахарозу и проводят дальнейшие операции, как описано в примере 2,Проведенные исследования показывают, что воздействие танина на различные субфракции белков крайне неодинаково, Результаты количественного соотношения белковых субфракций пшеницы, ячменя, кукурузы и сорго при различных концентрациях танина представлены в табл, 1 и 2, Из данных табл,1 и 2 следует, что наиболее чувствительными к действию танина (танинофильные белки) являются в-субфракции пшеницы и ячменя, и А - субфракции кукурузы и сорго.Использование предлагаемого способа распознавания танинсвязывающих белков по сравнению с известными позволяет дифференцировать белки по их способности связываться с танином в многокомпонентной системе, а также количественно вычислять соотношение танинофильных и танинофобных белков,Формула изобретения Способ определения танинофильности белков, включающий исследование взаимодействия белков с танинами в многокомпонентной системе с последующим учетом результатов, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения и удешевления анализа, при исследовании взаимодействия к белковым пробам,цобавляют градиентное количество танина, проводят электрофорез белков в полиакриламидном геле, после чего денситометрически определяют количественное соотношение белковых компонентов, по которому судят о степени танинофильности.1 о1хахххо 3 1Е 11оЮо 1О 1 с ххх хэ оо хЭх нхал Сга8 2Ю О)о а СЧ (О л л л л 0 Л СО о - м сч