Способ получения авидина

.ЯО 16435 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(71) Институт молекулярной биологииим. В.А.Энгельгардт а, Научно-произ водственное объединение "Биолар" АН СССРи МГУ им. М.В.Ломоносова(56) Огцл Б.М., Тошаз Е.1. РцгЫ 1 са 1 хол апй сгуз 1 а 11 каСоп оГ аг 1 ЖпВосЬеш, 1. 1970, 118 с. 67-70.(54 ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АВИДИНА(57) Изобретение касается гликопротеидов, в частности получения авидина (тетрамера гликопротеида смол .м. 67000), применяемого в медициИзобретение относится к способу получения авидина - биологически активного соединения, который находит применение в медицине, химической, микробиологической и пищевой промышленноо сти.Цель изобретения - упрощение процесса и повышение выхода.П р и м е р 1, Все операции, кроме осаждения органическим растворителем, проводят при комнатной температуре (18 25 С), На стадии фрикциони рования сульфатом аммония к 50 л свежего яичного белка добавляют 20 л денонизированной воды (соотношение 5:2), гомогенизируют и к раствору при пере(51)5 С 07 К 3/02 3/28//А 61 К 37/02 2не, Цель - повышение выхода целевого продукта и упрощение процесса. Последний ведут гомогениэацией яичного белка с последующими осаждением гомогениэата с помощью сульфата аммония в диапазоне концентраций 40-100 насыщения, растворением осадка в воде, повторным осаждением с помощью полярного органического растворителя при конечной концентрации последнего 40- 757, экстракцией иэ осадка авидина кислым буферным раствором при рН 6 хроматографированием экстракта на колонке с КМ-целлюлозой, элюированием, диалиэом и выделением целевого авидина. Выход 943, удельная активность 15,4 ед/мг, электрофоретичес- ф кая чистота 99,37Эти условия сокращают стадийность процесса с 10 до 5.2 табл. С Фв мешивании постепенно добавляют 30 кг сульфата аммония (657 насыщения) и 4 ф перемешивают до полного его растворения. ,С( Осадок отделяют центрифугированием Я (1200 д, 20 мин) и отбрасывают, К ф 56 л супернатанта при перемешивании ф постепенно добавляют сульфат аммония до полного насыщения раствора (около 10 кг). Осадок собирают иентрифугированием, супернатант отбрасывают.,ВНа стадии осаждения полярным органическим растворителем осадок, содержащий авидин, растворяют в деионизированной воде и разбавляют дооптической плотности раствора10 15 опт,ед/млн при 280 нм, Растворбелка перед добавпениам Оастворителяохлаждается до температуры от -2 до-4 С (смесь сухого льда с ацетономили смесь льда с поваренной солью).Органический растворитель добавляютохпажденным до температуры -30 до-500 С (низкотемпературный холодильник или жидкий азот, или смесь сухого льда с ацетоном) при перемешивании небольшими порциями, Температурасмеси пбдцерживается в пределах 21 О С.К 4 л охлажденного раствора белкадобавляют 6 л этилового спирта, Последобавления всего количества спиртаперемешивание продолжают 10-15 мин,после чего суспензию центрифугируют(1200 д, 20 мин),На стадии экстракции авидина изосадка после центрифугирования осадок объединяют и суспендируют с помощью гомогенизатора в 600 мп буфера0,1 М глицин/НС 1, рН 2,0 и перемешивают в теченйе 30 мин. Супернатантотделяют центрифугированием (1200 я,20 мин), осадок экстрагируют еще в500 мп того же буфера, Осветленныеэкстракты объединяют. рН раствора доводят до 68 (конц, БН 40 Н)На стадии хроматографии на КМцеллюлозе экстракт наносят на хроматографическую колонку с КМ-целлюпозой(5 Х 60 см), уравновешенной в буфере0,05 М ацетат аммония, рН 6,8, после чего через колонку пропускают0,05 М .ацетат аммония, рН 9,0 (2 л)и 0,37 карбонат аммония (2 л) со скоростью потока через колонку 500 мп/ч.Авидин элюируют ступенчатым градиентом концентрацией 0,4-1,07 карбонатааммония (в каждой ступеньке концентрация карбоната аммония увеличивается на 0,17), Элюат детектируют при280 нм, фракции тестируют измерениемактивности авидина в них. Фракции,содержащие авидин, объединяют,На стадии выделения целевого продукта, раствор авидина диализуют против деионизованной воды до удапениясолей и высушивают из замороженногосостояния,Весь цикл выделения осуществляет.ся в течение 6 рабочих дней. Выходпрепарата 947, удельная активность 515,4 ед./мг, электрофоретическая чистота 99,37, соотношение А /А,ЙЭО 360равно 1,78.Процесс очистки авидина характеризуется данными в табл, 1, где приведено выделение авидина на 50 л яичного белка.П р и м е р ы 2-.9. Обрабатывают5 л яичного белка, масштаб по сравнению с примером 1 1:10. Операция го . могенизации яичного белка, фракционирования сульфатом аммония,.осажденияорганическим растворителем, хроматографии на КМ-целлюлозе и выделенияцелевого продукта проводят как в при .мере 1В табл, 2 представлены численныезначения концентраций солей, растворителей, рН экстрагента и качественныепоказатели процесса и целевого продукта после лиофильного высушивания,Предлагаемый способ позволяет получить авидин из яичного белка по упрощенной схеме, количество стадий сокращено в 2 раза (с 10 до 5)с выходом на 15-207 выше. формул а изобретенияСпособ получения авидина из яичного белка, включающий гомогенизациюяичного белка, хроматографию содержащего авидин раствора на КМ-целлюлозес поспедущцей элюацией, диализом и выделением целевого продукта путем лиофилизации, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что, с целью упрощения процессаи увеличение выхода, гомогенизат осаждают сульфатом аммония в диапазонеконцентраций 40-1007 насыщения, оса Док РастВОРЯют В ВодепоВторно Осаждают добавлением полярного органического растворителя при конечной концентрации последнего 40-757 и авидинэкстрагируют из осадка кислым буферным раствором при рН 1,0-6,0, экстракт хроматографируют на колонке с6Таблица 1643554 Гомогенизат яичного белкаФр акционированиесульфатом аммонияЭкстракт осадкапосле осажденияорганическим растворителемЭлюат послеКМ-целлюпо зы 100 70000 57000 19900 0,00354000 77 19500 2,54 98 14,6 87 1,32 1100 94 15,4 1,21 1200 Твл н ц2 Характеристика конечного продукта пос ле иделения ия влкнта с ЮФ цаплюоаи Экстрахция рН Припер фр екцноюро в аниесульфатои аннония2 (пасыение) Осакденне органияескин растворителеи, Х Нетанол 2-Про- Лиепа пол тон Электрофо- А а /Ааа ретнческаяастога Х Вякал УдельХ ыея активность,ед./нг Этиловыййспирт 1-е 2-еосаиденне осакденне 60 75 75Ю40Ю Ю 70 Составитель Ве ВОпков Техреду Л.ОлийныкКорректор Л.Бескид . Редактор Н. Бобкова Заказ 1218 Тира 7 к 248 ПодписноеВНИИПИ ГосУдарственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР13035, Москва, 3-35, Раущская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгороде ул. Гагарина,101 65 70 40 70 40 30 80 65 60 00 00 100 100 90 100 100 100 90 0,1 И глнцнн/НС 1О, Р Н глнцнн/НС 10И июдсьоп/НС 10,1 И НС 10,1 Н НС 10,05 Н иещ атон/НС 11 ИНС 10,05 М трио/НС 10,1 Н глицны/НС 1 2,0 941,5 . 946,0 901,0 901,0 96,0 800 152,0 722,О 15,4 152 14,9 15,1 10,0 12,0 9,5 14,8 65 99,3 99,2 99,0 99,0 95,0 97,0 9 О,4 98,2 71,0 1,78 180 1,77 168 1,55 156 1 60 0,9 1,2